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近年来，研究表明生物膜的形成是导致大多数微生物感染和耐药性的关键因素。据估计，人体约有80%的慢性和复发性微生物感染是由细菌生物膜引起的。

生物膜为病原菌提供了多种生存优势，其中包括保护病原菌免受宿主免疫系统和抗菌药物的攻击，维持水分，增加对干燥环境的耐受性，吸收和储存营养物质，保持高细胞外酶活性，黏附于感染部位，细胞聚集，并通过群体感应协调毒力因子的表达。

传统治疗 *** 通常直接针对病原菌，但由于生物膜的存在，抗菌药物很难达到有效浓度，从而降低了治疗效果。

包裹在生物膜中的病原菌还可以通过代谢休眠细胞或分子持久性机制抵抗药物治疗，这也是导致生物膜相关感染在临床治疗停止后复发的原因之一。

根据2017年世界卫生组织发布的急需研发新型抗生素的重点病原体清单，大多数革兰氏阴性菌被列为重要目标。

与革兰氏阳性菌相比，革兰氏阴性菌由于其不可透过的细胞壁结构，对抗体和抗生素具有更强的抵抗力，且具有较高的发病率和死亡率。

铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯杆菌是最常见的引起临床感染的革兰氏阴性致病菌，也是本研究的研究对象。

细菌的生物膜主要由复杂的多糖、蛋白质、脂质和胞外DNA组成，这些组分统称为细胞外聚合物。

细菌通过产生细胞外酶来主动分散生物膜，这些酶能够降解细胞外聚合物的成分，如蛋白质、胞外DNA和胞外多糖，从而促进生物膜的分散，使细菌处于更加脆弱的浮游状态。

借鉴生物膜主动分散的机制，临床上已经开始使用重组人类脱氧核糖核酸酶I（rhDNase I）来靶向胞外DNA，从而打散囊性纤维化患者肺部的生物膜，并辅助抗生素治疗。

人工表达的表皮葡萄球菌分泌的丝氨酸蛋白酶Esp也可以通过降解细菌细胞外聚合物中的蛋白质，抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，并增强生物膜中金黄色葡萄球菌对人类β-防御素2（hBD2）的敏感性。

在大多数生物膜中，细胞外聚合物的主要成分主要是由胞外多糖分泌而来[2, 8-9]。胞外多糖对于细菌生物膜的形成和维持具有多种重要功能。

包括结构稳定性、对抗抗菌药物和宿主免疫系统的物理和化学防御、细菌间的黏附聚集、对干燥环境的耐受性、有机和无机化合物的吸收以及在营养不足时提供碳源等。

目前的研究已经证实，针对胞外多糖的糖苷水解酶具有抑制生物膜合成和破坏成熟生物膜结构的能力。

例如，源自铜绿假单胞菌胞外多糖合成途径的糖苷水解酶PelA47-303和PslG31-442不仅可以有效抑制细菌生物膜的形成，还可以破坏已形成的成熟生物膜。

进一步的体内实验显示，PslG31-442与妥布霉素联合应用可以提高抗生素的疗效，并增加铜绿假单胞菌感染伤口处的细菌清除率。

鉴于目前已发现的大多数化合物无法破坏成熟生物膜，或者需要较长时间（≥24小时）才能破坏已形成的生物膜，进一步挖掘具有快速有效破坏成熟生物膜能力的广谱糖苷水解酶对于细菌生物膜的治疗至关重要。

数据显示，研究人员已经取得了一些突破，但仍需更深入的探索。这些研究揭示了生物膜的形成对微生物感染和抗生素耐药性的重要性。

通过针对生物膜的关键组分，如细胞外聚合物和胞外多糖，以及应用具有糖苷水解酶活性的重组人类酶或细菌酶，可以干预和破坏细菌生物膜，从而提高抗生素疗效，减少感染复发风险。

尽管取得了一些进展，但仍有许多挑战需要克服。例如，如何选择合适的糖苷水解酶，以及在何种条件下使用这些酶来更大程度地破坏生物膜并降低耐药性风险仍需进一步研究。

研究人员还需要评估糖苷水解酶在体内的药代动力学和安全性，以确保其在临床应用中的有效性和可靠性。

材料

质粒与菌株

糖苷水解酶表达菌株 Escherichia coli BL21(DE3) 是从北京全式金生物技术有限公司购买得到的。表达质粒 pET 28a(+) 是由本研究所的赫卫清研究员惠赠的。

铜绿假单胞菌 PAO1 菌株和 PA14 菌株是由中国科学院南海海洋研究所的王晓雪研究员惠赠的。肺炎克雷伯杆菌（ATCC 700603）菌株是由本研究所的解云英研究员惠赠的。

培养基

LB 培养基是从美国 Invitrogen 公司购买得到的。BHI 培养基是从北京索莱宝科技有限公司购买得到的。

肺炎克雷伯菌株生物膜实验培养基的配方参照O'toole GA. Microtiter dish biofilm formation assay，基本培养基为 M63 基本培养基，添加了 *** 镁、葡萄糖和酪蛋白氨基酸成分。上述培养基均在 121 ℃ 下灭菌 15 分钟。

***

重组糖苷水解酶的表达与纯化

在本实验中，重组糖苷水解酶的基因序列经过北京华大基因公司合成，并进行了针对大肠杆菌表达系统的密码子优化，然后构建到 pET 28a(+) 质粒上。

共使用了13种蛋白质的NCBI序列号，分别为ECGH1（WP_001546226.1）、ECGH2（WP_000643258.1）、ECGH3（WP_000620931.1）、KPGH1（WP_040145971.1）、KPGH2（WP_012068486.1）、KPGH3（WP_012967893.1）、KPGH4（WP_002911497.1）。

KPGH5（WP_002914970.1）、KPGH6（WP_015958928.1）、KPGH7（ABR78659.1）、KPGH8（WP_009308665.1）、KPGH9（WP_015959147.1）和KPGH10（WP_004186817.1）。

首先，将表达糖苷水解酶的工程菌株经过LB固体平板活化，然后挑取单克隆菌落接种至含有25 μg/ml 阿莫西林的3 ml LB培养基中，在37℃、220 r/min 的条件下过夜培养。

随后，将过夜培养的细胞以1:100的比例转接至大容量摇瓶中，在37℃、220 r/min 条件下继续培养，直至细胞的光密度（OD600）达到0.5~0.6。

在此时加入终浓度为0.5 mmol/L 的IPTG诱导表达，并继续在18℃、220 r/min 条件下过夜诱导。

接下来，通过5000 × g、4 ℃ 的离心，收集诱导培养的菌体。菌体重悬于含有终浓度为20 mmol/L 咪唑、50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、300 mmol/L NaCl、2% V/V 甘油的结合缓冲液中，再次离心并用LB培养基洗涤菌体。

接下来，将菌液与添加了蛋白酶抑制剂PMSF（最终浓度为1 mmol/L）、抑肽酶（最终浓度为2 μg/ml）和亮抑酶肽（最终浓度为5 μg/ml）的结合缓冲液一起进行超声破碎，超声破碎条件为破碎10秒、休息10秒，共破碎30个循环。

破碎后，菌液经过2000 × g、4 ℃ 的离心收集上清液。上清液经过0.45 μm 滤膜过滤后与预先平衡的Ni基质在4 ℃ 下结合1小时。

结合后，使用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗柱子，最后使用洗脱缓冲液（250 mmol/L 咪唑；50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5；300 mmol/L NaCl；2% V/V 甘油）洗脱目的蛋白。

经过SDS-PAGE检测后，将目的蛋白用30 K超滤浓缩管置换缓冲液为1 × PBS，并备用。

生物膜抑制活性的测定

根据实验流程，我们首先取铜绿假单胞菌菌株PAO1和PA14，然后将其经过夜培养的LB平板活化。

活化后的菌株通过在37℃、220 r/min的条件下使用LB培养基进行过夜培养。接下来，我们使用BHI培养基以1:100的比例稀释菌液。

将稀释的菌液（每孔95 μl）加入无菌96孔微量滴定板中，然后向每孔添加5 μl不同浓度的糖苷水解酶样品，使得总体积达到100 μl。

我们使用1×PBS代替糖苷水解酶作为阴性对照，使用0.1 mg/ml的妥布霉素作为阳性对照。

将96孔板静置在25℃下孵育12小时，以形成生物膜。为了排除边缘效应，我们在所有边缘孔中加入200 μl无菌水，并用封口膜密封微量滴定板。孵育后，用去离子水彻底洗涤96孔板，以去除非黏附细胞和培养基，然后晾干。

接下来，向每孔中加入150 μl 0.1%（W/V）的结晶紫染色液，静置10至15分钟，然后再次用水冲洗并晾干。

最后，向每孔中加入150 μl 33%冰醋酸，溶解剩余的染料，并静置10分钟。通过在595 nm或600 nm下测量吸光度来确定生物膜的数量，所有的反应均重复进行3次。

对于肺炎克雷伯杆菌菌株，经过37℃、220 r/min的过夜培养后，我们使用与铜绿假单胞菌相同的 *** ，将其稀释并在无菌96孔微量滴定板中进行静态培养12小时，以形成生物膜。

结果

糖苷水解酶的表达与纯化

我们使用实验室中之前构建的13种糖苷水解酶表达菌株BL21(DE3)/pET-28a(+)，在添加0.5 mmol/L IPTG并在18℃条件下进行过夜诱导蛋白表达。

图1

通过SDS-PAGE分析表达后的菌体裂解液，结果如图1所示。随后，我们使用Ni柱对ECGH2、KPGH1-KPGH7这8种成功在上清中表达的蛋白进行纯化。

纯化后的蛋白缓冲液经过30 kD超滤管置换为1×PBS，并通过SDS-PAGE分析，结果见图2。

构建铜绿假单胞菌以及肺炎克雷伯杆菌生物膜筛选模型

首先，对pslG基因（AAG05625.1）进行PCR扩增，去除其跨膜片段，并将其构建到pET 28a(+)表达载体上，得到了包含31-442位氨基酸残基的表达质粒。

随后将表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)菌株中，诱导表达PslG31-442糖苷水解酶（见图2）。

图2

由于之前的研究表明，PslG31-442对铜绿假单胞菌PAO1菌株的生物膜具有活性，而对PA14菌株的生物膜没有活性，我们按照之前的 *** 建立了铜绿假单胞菌生物膜抑制活性筛选模型，并利用PslG31-442进行验证。

结果如图3A、B所示，PslG31-442对铜绿假单胞菌PAO1菌株的生物膜具有较强的抑制活性，而在相似浓度下对PA14菌株的生物膜没有明显的抑 *** 用，这验证了筛选模型的成功建立。

图3

由于铜绿假单胞菌是一种运动性细菌，在铜绿假单胞菌菌液的气液交界面上，经染色后可以观察到被结晶紫染为紫色的生物膜（见图4A）。

在此基础上，我们还成功建立了肺炎克雷伯杆菌的生物膜筛选模型。由于肺炎克雷伯杆菌是非运动性细菌，在平板孔底可以观察到被染为紫色的生物膜（见图4B）。

图4（AB）

酶活性初筛

利用之前建立的筛选模型，对纯化得到的8种可溶性糖苷水解酶的生物膜抑制活性进行粗筛。

结果如图5所示。ECGH2对铜绿假单胞菌PAO1和肺炎克雷伯ATCC 700603菌株的生物膜形成具有不同程度的抑 *** 用，但对铜绿假单胞菌PA14的生物膜形成没有抑 *** 用。

图5

而KPGH1和KPGH2仅对铜绿假单胞菌PAO1的生物膜形成具有一定程度的抑 *** 用，对铜绿假单胞菌PA14和肺炎克雷伯ATCC 700603菌株的生物膜形成没有显著的抑制效果。

BCA蛋白定量结果显示，8种糖苷水解酶中KPGH3的浓度更低，但从抑制生物膜形成的活性结果中可以看出，KPGH3在8种糖苷水解酶中具有最强的活性，并且具有跨菌株的活性。

对铜绿假单胞菌PAO1、PA14以及肺炎克雷伯ATCC 700603菌株的生物膜形成均有显著的抑 *** 用。因此，我们选择KPGH3进行后续的实验研究。

KPGH3对不同革兰氏阴性菌生物膜抑制活性的测定

在浓度范围为25 ~ 0.2 nmol/L的条件下选择7个不同浓度与菌液共孵育12小时，并利用结晶紫染色测定其吸光度，以评估KPGH3对3种菌株生物膜形成的抑制效果。

从结果可以看出，在24.56 nmol/L浓度下，KPGH3显示出对铜绿假单胞菌PAO1菌株生物膜形成的抑 *** 用，使用GraphPad Pri *** 7计算其EC50为36.85 nmol/L。

在相同浓度下，KPGH3对PA14菌株生物膜的形成具有相似的抑制效果，EC50为43.34 nmol/L。

与两种铜绿假单胞菌株相比较，在相同浓度的条件下KPGH3对肺炎克雷伯杆菌ATCC 700603菌株的生物膜形成的抑 *** 用较弱，经计算其EC50为82.58 nmol/L（见图6）。

图6

KPGH3 生物膜破坏活性的测定

本研究旨在评估KPGH3对铜绿假单胞菌PAO1菌株、PA14菌株以及肺炎克雷伯ATCC 700603菌株形成的成熟生物膜的破坏能力。

结果显示，在纳摩尔级别的KPGH3浓度下，其能够在1小时内迅速、有效地破坏不同菌株形成的老化生物膜。

尤其在浓度为24.56 nmol/L时，KPGH3对肺炎克雷伯ATCC 700603菌株形成的生物膜表现出最强的破坏活性。根据计算，KPGH3对这3种菌株生物膜的EC50分别为45.35 nmol/L、29.3 nmol/L和18.23 nmol/L（详见图7）。"

在本研究中，我们进行了一系列实验来评估KPGH3对不同菌株形成的生物膜的破坏能力。

首先，我们选择了铜绿假单胞菌的两个菌株，分别是PAO1和PA14，以及肺炎克雷伯的ATCC 700603菌株。这些菌株都是常见的致病菌，它们能够形成耐药性强的生物膜。

图7

为了测试KPGH3的生物膜破坏活性，我们使用了纳摩尔级别的KPGH3溶液。我们将这些溶液加入含有不同菌株形成的成熟生物膜的培养皿中，并在接下来的1小时内观察破坏效果。

结果表明，KPGH3能够迅速而有效地破坏这些菌株形成的陈旧生物膜。

有趣的是，在浓度为24.56 nmol/L的KPGH3作用下，对肺炎克雷伯ATCC 700603菌株形成的生物膜显示出最强的破坏活性。这表明KPGH3对于这种致病菌的生物膜有很高的破坏力。

我们还计算了KPGH3对这三种菌株形成的生物膜破坏活性的EC50值，分别为45.35 nmol/L、29.3 nmol/L和18.23 nmol/L（图 7）。这些数值反映了KPGH3在不同菌株的生物膜破坏过程中所需的有效浓度。

综上所述，我们认为 KPGH3 是一种富有应用前景的、能够靶向革兰氏阴性菌生物膜的糖苷水解酶，其酶学特征和多糖作用靶点将是该酶进一步研究方向。