聚醚类离子载体药物（polyether antibiotics，PEs）是20世纪70年代发展起来的一类具有离子载体性质的抗生素。多数由链霉菌发酵产物分离而得到。1951年，Berger等从土壤样本中分离到三种新颖的抗生素，其中就有拉沙洛菌素（ *** locid，LAS）。但由于毒性高、无临床使用价值并未引起重视，其后十几年时间无人问津。1967年Agtarap等发现了莫能菌酸的抗球虫活性并阐明了其结构，随后对该类化合物的研究不断深入，到目前为止已发现至少88种该类化合物。自1971年美国礼来公司开发出之一个聚醚类抗球虫药莫能菌素（monensin，MON）以来，盐霉素（salinomycin，SAL）、LAS、马杜霉素（maduramicin，MAD）、赛杜拉霉素（semduramicin，SEM）相继开发上市，PEs作为抗球虫的主导药物在生产中得到了广泛引用。但由于该类药物的安全范围较窄，使用不当易导致动物中毒，而且动物源性食品中残留的PEs可通过食物链传递给人，对人类健康也存在潜在的危害。本部分综述了PEs的理化性质、药理与毒理学、代谢与消除、国内外 *** 要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定 *** 等内容，以期为该类药物的全面了解和残留检测提供参考。
1理化性质
PEs作为一类药物在结构、理化性质和生物学效应方面很相似。PEs具有多环醚结构的有机酸，在其分子中，四氢呋喃和四氢吡喃含氧杂环以线性方式连接成基本骨架，骨架上含有多个甲基、乙基和羟基，个别化合物含有羰基、半缩醛、螺旋缩酮或一两个糖苷。目前，临床上应用的PEs主要有8种，结构见图5-62。
在溶液中或结晶状态下，PEs的游离酸或盐通过分子内氢键和疏水亲脂作用自卷呈环状构象存在PEs分子由氢键形成特殊结构，中心由于氧原子簇集而带负电，可以捕获阳离子；外部则由疏水的烃基构成。因此PEs既可结合阳离子，又有亲脂性，可沿生物膜扩散，具有离子载体的性质。不同PEs对各种金属离子（主要是碱金属离子）的亲和性是有差异的，绝大多数PEs如MON、SAL、MAD属于单羧基离子载体抗生素，仅选择性结合单价阳离子，如Na＋、K＋。而LAS除可与单价阳离子结合外，还能结合二价阳离子，如Ca2＋、Mg2＋。
PEs呈酸性，pKa6～8。PEs酸根与碱金属离子形成的电中性络合物较游离酸稳定，因此临床上一般用其钠盐。PEs的游离酸或盐形式具有相似的溶解性:不溶于水，但在大多数有机溶剂如异辛烷、苯、氯仿、乙醚中都有很高的溶解度。PEs呈白色结晶状，相对分子质量多为500～1300，熔点很高，为140～270℃，比旋度较低。饱和多醚的紫外分析表明呈末端吸收（210～220nm），但不饱和的或含有芳香环的多醚如LAS具有特征吸收峰。
2 药理与毒理学
PEs通过携带阳离子沿生物膜扩散而导致膜两侧的离子浓度梯度的改变，从而影响细胞的生理机能PEs分子可以分为两个部分:一部分可以在细胞膜上形成水性通道，另一部分则可以与离子结合，协助离子通过水性通道转运。这种运输模式类似于蛋白质的跨膜转运。细胞内、外液的离子浓度梯度是通过Na+-K＋-ATPase、Mg2＋-Ca2＋-ATPase和Na＋-Ca2＋交换机制维持在正常水平的。PEs可通过影响Na＋、K＋、Ca2＋的平衡导致细胞内游离Ca2＋浓度急剧升高，从而产生一系列细胞毒性效应。
PEs产生毒性作用的另一机制是影响细胞的能量代谢。细胞维持膜两侧的正常离子浓度梯度是需要消耗能量的。以MON为例，它可导致Na＋大量进入细胞内。为了将过量的Na＋排出，细胞需要消耗ATP，而细胞产生的正常的ATP量无法满足增大的需求，从而导致细胞因能量枯竭而死亡。
PEs主要作用于球虫子孢子或之一代裂殖体，因而特别适宜用作预防药物，有效预防浓度一般为100g/t（饲料）或更低。其抗球虫谱广，对各种艾美耳球虫均有强的抑杀作用。PEs的突出优点是球虫不易对其产生抗药性。这是由于PEs的离子平衡干扰机制缺乏特异性。
PEs对离子平衡的影响产生的一个正面效应是通过控制瘤胃发酵来提高饲料利用率，从而对多种动物具有明显的促生长作用。南京农业大学做了一系列海南霉素（hainanmycin，HAN）对山羊代谢的影响的研究。
大部分PEs的毒性比较大，在毒理学上属高毒或剧毒物质。表5-41为PEs对不同动物的经口LD50。杨桂香等通过试验测得，MAD对于肉鸡的LD50为55348mg/kg。除了毒性大，PEs安全范围较窄，在饲料中的含量稍大可使动物的增重减慢、饲料转化率降低。
对离子浓度梯度的影响即是PEs的治病机制，但当用药不当使得体内药物浓度过高，超过了机体的清除能力时，也成为PEs的致病机制。研究发现，静脉注射小剂量的MON可产生选择性的冠状血管扩张效应，剂量加大时能引起心收缩率加快及收缩强度加大。一些对ATP依赖性强的组织最敏感，如心肌、膈肌等。邓干臻等研究了MAD对肉鸡的临床毒性。结果显示，饮水给药的浓度超过8mg/L时，MAD对肉鸡的神经系统、肝脏、肾脏及胸肌会产生不同程度的毒性作用。人类PEs中毒主要表现为横纹肌溶解症，严重时伴有多脏器功能衰竭。
陈宏研究了SAL对小鼠机体的氧化损伤及生殖毒性作用。试验表明，SAL对小鼠肝脏、肾脏、血浆、睾丸有不同程度的氧化损伤作用，但对雄性小鼠的 *** 畸形率的影响不显著。研究还表明，SAL能引起早期鸡胚发育死亡。这说明动物源性食品中SAL的残留对人体的抗氧化机能及生殖健康有潜在的危害性。
3代谢与消除
PEs在动物体内通常难以吸收，排泄速度又较快，在动物组织及其产品中无残留。美国FDA规定，MON、SAL和LAS的休药期为0d。然而，一些研究者也认为，某些PEs在动物体内吸收程度较高，如肉鸡静脉注射或嗉囊内注射SAL，研究其药动学参数，结果显示经口给药时生物利用度可达73%，吸收半衰期为364h；给鸡饲以含SAL（浓度为60×10－6）的预混剂，血药浓度较单剂量经口给药（20mg/kg）低。Donoho和Davison的胆管插管试验显示，MON在各种动物胃肠道内的吸收程度差异较大:其在单胃动物体内可完全吸收，反刍动物吸收36%～40%，鸡吸收11%～31%。PEs及其代谢物主要经过粪便排出体外，少部分经尿液和呼吸排泄。PEs在体内分布广泛。一般来说，其代谢物主要存在于肝组织，原型药物则主要分布于脂肪组织。PEs在体内的消除速度以SAL最快、LAS最慢。对PEs敏感的动物血浆中药物的消除速度较慢。PEs的组织代谢动力学资料见表5-42。
王伟研究了甲基盐霉素（narasin，NAR）在鲤体内的药动学及残留规律，数据见表5-43。肌肉、肝脏和鱼皮的消除半衰期分别为1.86d、1.72d、2.09d。且这些组织中仅检出原型药，并未发现代谢物。由此显示，NAR原型药在鲤肝脏中消除最慢，残留时间最长，故确定NAR原型药在鲤体内的靶组织为肝脏，残留标志物为NAR原型药，NAR在鲤体内休药期为3d。
4国内外 *** 要求
残留监控中一般选择原型药作为残留标志物。对于各种PEs的MRL，美国、日本等制定的PEs的MRL一般不超过1.0mg/kg。我国农业部235号公告对PEs在动物源性食品中MRL做了规定:如MON在肌肉、肝中的MRL分别为1.5mg/kg、4.5mg/kg；SAL在肌肉、肝中的MRL分别为0.6mg/kg、1.8mg/kg；MAD在肌肉、肝中的MRL分别为0.24mg/kg、0.72mg/kg。欧盟自2006年起禁止将SAL钠、MON钠用于饲料、促进生长的抗生素在饲料中添加。
5样品前处理 ***
5.1提取
PEs在有机溶剂中普遍有很高的溶解性，甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、苯、正己烷、异辛烷等溶剂都可用于PEs的提取，应根据样品基质的性质和净化 *** 进行选择。如Chéneau等采用乙腈提取鸡血浆中的MON，而采用甲醇-水（87∶13）提取鸡肉、肝脏、脂肪中的MON。动物组织中常用甲醇、乙腈或与水的混合物（含水量不超过20%）进行提取。甲醇-水（4∶1）组织渗透性高，蛋白质沉淀能力强，应用较广泛，但甲醇对亲水性和亲脂性物质的溶解性均较强，提取液中杂质较多，特别是一些脂肪酸等极性杂质的存在易对PEs的衍生化检测产生干扰。饲料样品常用乙腈作为提取液。
PEs中LAS的极性更高，在样品处理中易由于吸附作用而损失，造成回收率下降。向牛和犬的血液样品中加入适量氢氧化钠能增加乙酸乙酯对LAS的提取效率，对于高水平的样品尤其明显。但氢氧化钠加入量过高会导致LAS的β-羟基酮结构分解，回收率降低。
5.2净化
PEs的游离酸或盐形式具有相似的脂溶性，均不溶于水，所以不能通过调节萃取介质pH的 *** 将待测物与杂质分离。但是，根据这一特性却能利用LLE除去提取液中水溶性杂质，尤其是甲醇或乙腈提取液中的强极性干扰物质。
由于PEs的脂溶性，适于用正相SPE对提取液进行净化。氧化铝柱能有效除去脂肪和脂肪酸，后者对许多PEs的衍生化反应和检测有干扰。但是氧化铝柱会强烈吸附PEs中极性最强的LAS，因此净化LAS时一般使用硅胶柱。
Olejnik等发现，单独使用HLB柱或Silica柱，虽然可以满足鸡蛋和肌肉中LAS、MAD、MON、NAR、SAL、SEM等药物残留提取的净化，却无法充分净化肝脏基质的提取液。将二者联用，首先采用HLB柱除脂，然后用Silica柱进一步净化则可取得良好的效果，回收率为80%～128%。其中LAS的回收率更低，推测可能是Silica柱的极性吸附作用的影响。
较早报道的净化 *** 主要是为各种TLC-BAG设计的。由于检测灵敏度较低，因此对样品的净化要求很高，为以后各种PEs残留分析中样品的处理 *** 提供了参考。
Bertini等采用改良的TLC法检测马饲料和肝脏中的MON和LAS。样品用甲醇提取后，在进样检测前，饲料基质需要经过正己烷进行LLE除脂和硅胶柱净化，而肝脏基质可将提取液进行离心、浓缩后直接进样。这是因为饲料基质中的色素对检测存在干扰。
由于MS的高选择性和灵敏度，样品的净化步骤较为简洁。Hormazabal等研究饲料基质中的LAS、MON、NAR和SAL的检测 *** ，采用不同比例的甲醇-水经过反复离心，不需其他的净化步骤，提取液即可直接上机检测。Chéneau等建立了鸡血浆及可食用组织中MON的LC-MS/MS的定量 *** 。对于血浆，用乙腈提取，离心后的上清液用氮气吹干，乙腈-乙酸铵（80∶20）复溶，进样测定。对于肌肉、肝脏和脂肪，甲醇-水（87∶13）提取后用Bond Elut C18 SPE柱进行净化，用氮气吹干浓缩后乙腈-乙酸铵（80∶20）复溶，进样测定。色谱图见图5-63、图5-64。
随着人们对环境毒理学的日益关注，PEs在环境中的残留检测开始见诸报道。Martínez-Villalba等采用LC-MS/MS *** 研究了河水中LAS、MON、SAL、MAD和NAR的残留。由于样品基质即为水溶液，不需要提取，直接采用C18SPE柱进行净化和浓缩。 *** 的检测限不超过71ng/L。VesnaFurtula等采用甲醇提取、玻璃微纤维过滤以及C8柱净化、LC-MS/MS对禽排泄物及土壤中的MON、SAL、NAR残留进行了分析。
6检测 ***
PEs的检测 *** 可分为直接检测法和衍生化检测法。已报道的PEs直接检测法包括UV、红外检测（IR）、示差检测（RI）、AAS、MS和IAS，其中只有MS和IAS被用于进行PEs残留检测。LAS由于结构中含有酚甲酸结构，是能用分光光度法直接检测的唯一PEs。
衍生化检测法包括HPLC的紫外/可见光检测（UV/Vis）衍生化法、荧光衍生化法和GC的热解衍生化法等。尽管各种PEs中含有的活性基团如羟基、羧基、酮基、缩醛或半缩醛等，都可以用于衍生化反应，但仍然有以下问题需要注意:①空间位阻。有些PEs活性基团的空间位阻较大，不易与衍生化试剂反应。②活性基团的理化性质。如含半缩醛或缩醛结构的PEs对酸性条件敏感，含β-羟基酮结构的PEs对热和碱性条件敏感。③样品基质中内源性物质的干扰。因此PEs的衍生化 *** 相当复杂。
6.1 UV/Vis衍生化检测法
UV/Vis衍生化主要包括芳醛衍生化、重铬酸吡啶氧化和2，4-二硝基苯肼衍生化。
芳醛衍生化的原理是科马罗夫斯基反应（Komarowsky），即在强酸和无水条件下，PEs与芳醛（如香草醛、对二甲氨基苯甲醛、对甲氧基苯甲醛等）作用生成有色物质，在可见区有强吸收，可用分光光度法检测。该法操作简单，是PEs的之一个化学衍生化 *** 。其缺点是Komarowsky反应条件剧烈，分析条件不易重复，结果变异较大。Golab等首次采用该 *** 建立了预混剂中MON的分光光度检测法。
薄层色谱法（TLC）检测原理与此类似。样品经TLC展开后晾干，喷以香草醛反应液，60℃加热5min后，MON呈红色，SAL和NAR呈紫色，LAS呈黄色。可采用分光光度法定量。TLC定量检测的局限性在于饲料或动物组织中存在的大量含羟基或羰基的物质可能无法与PEs有效地分离，从而对PEs的测定产生较大的干扰。因此TLC法较少用于残留分析。Bertini等改良了TLC法，以定量检测饲料和肝脏（马）中MON和LAS的含量。这套HP-TLC谱系统包含三部分:自动进样器、扫描仪（紫外及可见光吸光度测定模式）、WinCats®软件。采用高压氮气将样品喷射在硅胶板上，用乙酸乙酯-正己烷（70∶30，V/V）展开，90℃下5%香草醛-甲醇- *** （99.5∶0.5，V/V）反应5～15min。MON呈现狭窄的粉红色带，可稳定数小时不褪色，LAS在浅黄色板块上呈现橘色，1 h后开始褪色。在500 nm处进行定量测定。
同样应用Komarowsky反应，将LC与荧光免疫分析（FIA）结合起来，建立柱后衍生化LC测定法。此法将待测物与样品基质分离后进行衍生化和检测，有效避免了基质干扰，分析条件易优化，结果重复性好，是目前唯一的PEs柱后衍生化 *** 。影响该 *** 灵敏度的主要因素包括芳醛的种类及浓度、 *** 的浓度、反应温度、反应时间等。一般地，香草醛与PEs反应速度快，应用最多，检测波长为520 nm，使用对二甲氨基苯甲醛做衍生化试剂时灵敏度较高（检测波长为600 nm）；衍生化试剂中香草醛的浓度一般为3%～4%， *** 浓度为2%～3%；反应温度为95～120℃。MON、SAL和NAR反应灵敏度高，LAS和MAD反应灵敏度较低。
陈明等在研究鸡蛋中MON、SAL的检测 *** 时，采用双柱后衍生化反应进行LC-UV的测定，即采用两个柱后衍生反应器，使MON和SAL在柱后分离后与衍生试剂1（ *** ）和衍生试剂2（香草醛）在不同的反应器、反应体积和反应温度下分别发生反应。虽然大多数研究是将衍生试剂 *** 和香草醛配制在一起，但陈明等认为，混合衍生试剂不稳定，需现配现用并避光保存。而采用单衍生试剂、单反应器，在检测过程中可能造成衍生反应不完全、不稳定，影响样品分离检出和检测的精确性。采用双柱后衍生反应器测定鸡蛋中MON、NAL的残留量，具有特异性强、灵敏度高等优点，可满足残留检测的要求。
关于另外两种 UV/Vis衍生化 *** (重铬酸吡啶氧化法和２,４-二硝基苯肼衍生化法)的应用很少Dimenna等利用选择性氧化剂沙瑞特试剂（CrO3·[C5H5N]2）将SAL C20位上的仲羟基氧化，生成α，β-不饱和酮结构。该化合物在225nm处有强的UV吸收。Mathur对SAL与DNP的反应动力学和产物的性质进行了研究。结果显示，SALC11位羰基与DNP脱水后生成的腙衍生物在419nm处有更大吸收。Dusi等用甲醇提取饲料中的LAS、MON、SAL和NAR，不经过净化步骤，用DNP在酸性条件、55℃下衍生化后，直接进行LC-UV检测。衍生化后的色谱图如图5-65所示。 *** 的回收率为85%～100%。
6.2荧光衍生化检测法
主要包括三种 *** :9-蒽重氮甲烷（ADAM）衍生化、1-溴乙酰芘（1-BAP）衍生化和丹酰肼（dansylhydrazine）衍生化。
ADAM是位阻羧基的烷基化剂，具有反应活性高、反应条件温和、衍生化产物荧光强度高的优点。固体ADAM性质不稳定，无法长时间保存，但其无水乙醚溶液在－20℃避光条件下能存放至少5个月。虽然ADAM对羧基具有很高的反应活性，但由于PEs分子的羧基空间位阻较大，且与金属离子螯合，活性较低，故应先将其转换成游离羧基后再进行衍生化。极性介质能显著加快PEs与ADAM的衍生化反应速度。PEs与ADAM衍生物的λex为365 nm，λem为418 nm。Martinez等首次将ADAM荧光衍生化法应用于PEs残留分析。其后又有若干相关文献报道。但该类 *** 多数需要复杂的样品前处理步骤，且回收率和灵敏度较低，限制了它的实际应用。
1-BAP衍生化反应需要冠醚作为催化剂，利用冠醚分子的空穴结构结合PEs络合的钠离子，暴露PEs的酸根，PEs酸根进攻1-BAP溴乙酰基团的中心碳原子，生成荧光衍生物1-BAP酯。
Asukabe发现Kryptofix-222（K-222）对PEs与1-BAP的反应具有很高的催化作用。
丹酰肼衍生化原理是:MAD末端F环的半缩醛在稀酸中会水解成酮糖结构，与丹酰肼缩合生成具有强荧光的腙衍生物，在λex＝220nm、λem＝470nm的条件下进行检测。
6.3直接荧光检测法
该法只能用于LAS的检测。
介质的pH对LAS的UV和荧光光谱有重要影响。这是由于在碱性条件下，酚甲酸结构发生解离，增加了苯环上自由电子的密度，从而有利于激发强的荧光；而在酸性条件下，游离羧基的吸电子效应则使荧光淬灭。故LAS的测定条件一般为偏碱性，但需要注意的是，流动相的pH应低于8.0，否则会加速以硅胶为担体的柱填料的流失。
鸡饲料和组织中常存在大量类胡萝卜素，其UV吸收峰在415nm附近，溶解性与LAS相似，可能对检测产生干扰。
6.4液相色谱-质谱（LC-MS）法
PEs光谱检测技术复杂，而MS则可以作为PEs的通用检测器应用。PEs相对分子质量大，难汽化，热稳定性差，用GC-MS测定相当困难。因此除LAS外，其他PEs的相关资料极少。20世纪90年代以来，LC-MS特别是LC-ESI-MS技术逐渐成熟，为PEs残留的确证分析提供了强有力工具。近年来报道增多（表5-44）。
6.4.1 GC-MS法
1983年，Weiss首次应用GC-MS法化学电离源（CI）模式对牛肝组织中LAS进行了分析。需要采用BSTFA对样品进行在线衍生化处理。LAS的β-羰基酮结构在GC汽化室（280℃）中发生逆羟醛缩合的裂解，生成相应的醛衍生物和酮衍生物。醛衍生物被质子化产生m/z 381峰，继而脱去TMS-OH产生m/z 291峰；酮衍生物经质子化和失水后产生m/z 337峰，质子化和脱去四氢呋喃产生m/z 211峰。若质谱图中存在上述碎片离子，并且LC或GC保留时间与标准品一致，则可做出确证。 *** 检测限为0.05mg/kg。
6.4.2 LC-MS法
较早报道主要采用LC-TSI-MS技术。但是TSI接口技术难以获得PEs的分子离子峰。ESI是目前广泛应用的LC-MS接口技术，特别适用于中强极性和热不稳定性化合物的分析。
Blanchflower等在鸡蛋中LAS的检测研究中发现，酸性流动相（流动相中添加TFA）对防止LAS拖尾相当重要，但对离子化无影响，此色谱条件下只能获得正离子ESI-MS。流动相中含适量甲醇（低于10%）能大大提高离子峰强度（3倍）。THF的存在有助于调节保留时间和保持对称的峰形。该 *** 可得到强的加合离子峰（基峰）m/z 613 [M＋Na]＋、m/z 608 [M＋H2O]＋和m/z 591[M＋H]＋。
MaríaJoséGonzálezdelaH等研究了甲酸-1甲醇-水（0.1∶90∶10）（A相）和甲酸铵＋甲醇（10∶90）（B相）两种溶剂系统中SEM、MON、NIG（内标物）、MAD、SAL、NAR和LAS的质谱行为。结果显示，虽然大部分PEs（除了MON）在A相（酸性条件）中形成的Na加合离子峰的丰度要大于B相中形成的铵加合离子峰的丰度，但是在A相环境下药物存在保留时间重合的情况，无法良好地分离，同时铵加合离子峰的丰度能够达到检测要求，故采用甲酸铵-甲醇作为流动相。
Mortier等研究了 NAR、MON、LAS、SAL在鸡蛋中的多残留检测 *** 。样品用乙腈提取，离心浓缩后溶于乙腈-水（90∶10），LC-MS进样测定。LC-MS分析条件:150 mm×2.1 mm C18柱，流动相为两相:A相为水-乙腈（95∶5），B相为乙腈。A、B各含0.1%甲酸。甲酸的作用是加强离子化、改善峰形（尤其是LAS）。流速0.25mL/min。锥孔电压80V，毛细管电压1.5kV，分别选择[M＋23]＋m/z 787、693、613、773进行检测。样品的质谱图和选择离子监测图（[M＋23]＋，1μg/kg添加浓度）见图5-66和图5-67。
6.5免疫分析法
由于PEs的高分子量和较多的官能团，同时又缺乏紫外吸收和电化学特征，理化分析技术困难。近年来研究者针对临床常用药物如MON、SAL、甲基SAL、LAS、MAD等相继建立了放射免疫法（RIA）、ELISA、荧光偏振免疫分析 *** （FPIA）、时间分辨荧光免疫分析（TRFIR）以及免疫亲和色谱法（IAC）等免疫分析技术。免疫分析法具有灵敏度高、特异性强、样品前处理简单、分析时间短等优点，可实现PEs残留样品的高通量筛选测定。
6.5.1 半抗原及人工抗原的合成
从免疫化学分析角度看，PEs属小分子化合物，不具备免疫原性，必须与载体蛋白连接后才能 *** 机体产生抗体。合成PEs半抗原的 *** 基本上分为两类: 一种 *** 是将PEs钠盐转换成相应的羧酸形式作为半抗原。通过混合酸酐（MA）法、碳化二亚胺（CDI）或活性酯（AE）法将半抗原的游离羧基与载体蛋白上的氨基直接相连制备人工抗原。
Heitzman等将MON溶于纯水使其呈悬浊液，经6mol/L盐酸酸化、乙醚萃取和浓缩后制得MON的游离酸，通过MA法或CDI法制备人工抗原。Elissalde等将SAL溶于DMF，通过Dow50-W阳离子交换树脂（经1mol/L盐酸处理过的），得到SAL的游离酸，通过AE法与KLH或BSA偶联制备人工抗原（图5-68）。沈建忠等将MAD溶于无水乙酸乙酯，用1mol/L盐酸酸化，重蒸水洗涤、干燥，得到MAD的游离酸，再通过MA法或AE法与载体蛋白连接。
另一种 *** 是利用PEs末端羟基构建间隔臂和活性基团合成半抗原。Pauillac等在无水吡啶的催化下，通过琥珀酸酐将MON的26位OH -酰化，再经二氯甲烷萃取和硅胶柱层析分离纯化，得到半抗原改造产物26-O-半琥珀酰MON，通过MA法与载体蛋白（BSA或OVA）结合（图5-69）。Mount等将MON溶于二氯甲烷，以无水吡啶做催化剂，与2-溴乙酰溴反应，产物经氯仿萃取和浓缩后，得到半抗原26-溴乙酰MON，用TLC和IR进行结构鉴定，然后在硼酸锂缓冲液（pH 9.4）下反应制备成所需的人工抗原（图5-70）。
上述两种半抗原合成 *** 可分别用于制备免疫原和包被原，以提高 *** 的灵敏度。
由于多数PEs化合物并无紫外吸收特征，因此常用的紫外法并不适合PEs结合物中半抗原结合比的测定。已报道的 *** 中主要是2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）比色法，其他 *** 如同位素示踪和凝胶电泳。Pauillac等在测定MON与蛋白质的偶联比率时采用了两种 *** :一种是通过测定带香草醛的MON替代物进行测定；另一种是通过半抗原26-O-半琥珀酰MON合成中掺入放射性的琥珀酸酐，据此计算结合比。但这两种 *** 比较麻烦，尤其是存在放射性污染问题。PEs的分子量较大，可采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法，通过比较结合物分子量和载体蛋白分子量来测定结合比。
6.5.2 抗体制备
PEs结构复杂，分子量较大，易于诱导高选择性和高亲和力的抗体。目前已制备出针对MON、LAS、SAL、NAR、MAD和SEM的单克隆和多克隆抗体。这些抗体均具有严格的选择性和很高的亲和性，一般与其他药物无交叉反应。
6.5.3免疫测定法
免疫测定法的样品处理 *** 与理化检测 *** 相似。但有一点，样品基质对免疫分析有一定影响。目前消除基质干扰最简便的 *** 是对样品进行稀释，但考虑到 *** 的灵敏度，稀释倍数也不能太大；另外就是使用大分子蛋白如酪蛋白、鱼皮胶等或表面活性剂如吐温-20作为基质掩蔽剂；或是采用LLE或SPE等净化手段。
Crooks等建立了鸡肝中MON残留的直接竞争ELISA *** 。样品经乙腈-水（5∶1，V/V）提取，正己烷-乙醚（1∶1，V/V）净化脱脂，浓缩后溶于乙酸钠-10%乙醇，直接竞争ELISA测定。定量范围1～50ng/g，检测限为2.91ng/g。Watanabe等建立了MON残留的间接竞争ELISA *** ，鸡血浆的基质效应远大于牛奶，需1∶10倍稀释的鸡血浆介质标准曲线的IC50与1∶2倍稀释的牛奶介质的IC50相近，但仍高于缓冲液的IC50。经甲醇提取、氯仿萃取后可消除基质对更大吸光度和IC50的影响。瞿永前等将MON以30.0μg/kg、60.0μg/kg、120.0μg/kg 3个浓度分别添加到经处理的各空白组织中，用间接竞争ELISA测得MON在肉鸡鸡肉、肝脏、肾脏和脂肪组织中的回收率为78.7%～104.3%，变异系数为4.2%～18.0%，检测限为5.0～8.5μg/kg。
Muldoon等将鸡肝组织经Tris缓冲液（pH775）-0.005%吐温-20提取，离心后取上清液，进一步稀释后（1∶10、1∶50、1∶100倍）上样检测，结果表明1∶100稀释液其标准曲线的IC500.98ng/mL与缓冲液介质的IC500.63ng/mL无显著差异（P＞0.05）。将ELISA *** 与HPLC-PCD *** 进行比较，两者有良好的相关性，相关系数r2为0.999。ELISA的定量限0.05mg/kg，而HPLC-PCD为0.1mg/kg。Watanabe等利用抗SAL单克隆抗体（McAbs）建立了ELISA *** ，并发展了胶体金免疫层析 *** 。定量范围为0.05～25.6ng/mL，IC50为0.7ng/mL。ELISA *** 对血浆、鸡肝、鸡肉的检测限为10ng/mL，胶体金试纸条对血浆和鸡肉的检测限分别是50ng/mL和300ng/mL。
Kennedy等利用抗MAD多克隆抗体建立了鸡组织中MAD残留的ELISA *** 。检测限是0.02μg/kg，定量限为1.0μg/kg。Chen等制备了高选择性和高亲和力的抗MADMcAbs，对其他PEs几乎无交叉反应，优化后的IC50为（2.12±0.46）ng/mL（n＝20）。鸡肉和鸡肝样品经甲醇-8%氯化钠（4∶1，V/V）提取，用PBS-10%甲醇直接稀释后测定。在添加为40～480μg/kg水平下，回收率为81.3%～91.3%，变异系数为52%～121%，鸡肉的检测限是65μg/kg，鸡肝的检测限是9.2μg/kg。Klciner等用建立的RIA检测动物组织中MD残留，该 *** 的灵敏度较高，检测限在0.025mg/kg以下，完全可满足动物组织中MD检测要求。但是由于RIA需要专门的仪器设备，且需要合成放射降解物，具有一定的繁琐性和危险性，难以推广应用。
Godfrey等将抗MON兔血清与氨基活化的多孔硅胶连接，制成免疫吸附剂，通过IAC对鸡组织进行净化。木瓜蛋白酶水解，随后IAC柱分离，最后通过化学发光ELISA（cELISA）定量检测。检测范围为0.1～10ng/mL，检测限为0.06ng/mL。沈建忠等首次制备出针对MD的特异性高容量免疫亲和色谱柱（Ⅰ柱动态柱容量为3750ng/mL胶，Ⅱ柱为7 160ng/mL胶）。组织样品用甲醇提取，经IAC柱分离纯化，ELISA *** 检测，即建立IAC-ELISA *** 。检测时，只需制备以PBST-10%甲醇为介质的标准曲线即可。该 *** 的检测极限为0.9～28.μg/kg。在300～1200μg/kg添加浓度范围内，回收率为76.4%～109.0%，变异系数为3.8%～17.9%。
Wang等合成了MAD荧光标记物MD-EDF，并首次建立了检测MD的FPIA *** ，比较了纯化的多克隆抗体的和未纯化的多克隆抗体对FPIA参数的影响，纯化前后的IC50分别为160ng/mL和4 100ng/mL，说明纯化多克隆抗体在建立FPIA *** 时可以改善检测灵敏度。在空白鸡肉、鸡脂肪和鸡蛋中添加MD，添加浓度分别为2.5μg/g、5μg/g和10μg/g，经甲醇提取后，平均回收率为82%～130%，批内变异系数为3%～8%，批间变异系数为7%～155%。Wang等制备了抗SALMcAbs，并据此建立了检测SAL的FPIA *** 。检测范围为0.60～2 193ng/mL，IC50为33.2ng/mL，检测限为0.08ng/mL。与甲基SAL交叉反应率为67.6%，与其他药物无明显交叉反应。
Peippo等建立了鸡肉、鸡蛋中甲基SAL和SAL残留的TRFIA。鸡肉匀浆后经乙腈提取、SPE净化，浓缩后溶于Tris-盐酸缓冲液（pH7.75）[0.5%酪蛋白，0.0.1%-吐温40，20μmol/L二乙烯三胺五乙酸（DTPA）]。鸡蛋也是经过简单的乙腈提取后直接测定。甲基SAL、SAL在鸡肉组织和鸡蛋中的平均回收率分别为91.0%、81.1%。两者的回收率并无显著差异（P＞0.05）。在鸡肉、鸡蛋中的检测限分别是0.56μg/kg、0.28μg/kg，定量限分别是1.80μg/kg、0.57μg/kg。在空白鸡肉、鸡蛋中添加甲基SAL浓度分别为2μg/kg、1μg/kg，批内变异系数分别为3.8%、4.5%，批间变异系数分别为4.1%、6.4%。Hagren等建立了鸡蛋中MON残留的TRFIA法。经乙腈简单提取后直接检测，检测限为1.2μg/kg，定量限小于2μg/kg。批内变异系数小于10%，批间变异系数为10.3%～139.%。在2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg3个添加浓度下，平均回收率88.0%～102.1%。
6.6 其他 ***
Johnson建立了一种饲料中MAD铵盐的在线LC-原子吸收光谱法（AAS）。该法是将MAD转化成铵盐形式，进样测定。该 *** 亦可用于测定MON和LAS。
多数PEs检测均可采用TLC-BAG法，该 *** 曾在PEs残留分析中发挥了重要作用。最常用于检测的菌种是枯草杆菌。TLC-BAG检测限一般为0.01～0.25mg/kg。其缺点是操作费时，结果变异大，选择性及分离能力远不如HPLC，一般仅适宜作为半定量或筛选分析 *** 。
罗洁等建立了用高效毛细管电泳 (HPCE)Ｇ电导分离检测技术测定饲料添加剂中 SAL含量的 *** 乙醚提取样品，甲醇-水溶液复溶，在熔融石英毛细管（50μm×50μm）中，以12mmol/L Tris-1mmol/L醋酸-0.2mmol/L柠檬酸为电泳运行介质，分离电压12.0kV，采用CE-电导分离检测法在5min内实现了SAL的分离检测。检测限为1mg/L，回收率为93.0%～100.1%。
对于PEs的微生物法国内外研究得较少，依据李娜等在PEs残留检测 *** 研究进展中的报道，潘蕴慈、Cabadaj、Kozarova等学者进行过此方面的研究。2007年，李娜等以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌和枯草杆菌4种菌为工作菌，首次在国内建立了检测鸡组织中3种PEs（MON、SAL、MAD）残留的微生物法，并应用于3种药物在鸡组织（肌肉、肝脏和肾脏组织）中的残留量研究。结果表明:同一药物在不同菌种条件下的更低检测限各有不同。筛选出枯草杆菌为最适工作菌。
虽然微生物法的灵敏度、准确性都不及其他几种残留检测 *** ，如HPLC、CE、LC-MS等分析 *** ，但是作为最常用的筛选 *** ，它的优点表现在以下几个方面:①微生物法有良好的剂量关系，微生物筛选 *** 抑菌圈与实际药物含量的相关性好。②微生物法具有很大的广泛性，因为任何抗菌药物及活性抑菌成分都能抑制微生物的生长。③用微生物法检测动物性组织中的兽药残留时，前处理简单、不需特殊设备，并且能同时筛选大量的样品，适合用于分析药物残留的初步检测。在李娜等的研究中，MON、SAL在各组织中的更低检测限也远低于国标规定的MRL。