无菌检查培养基的培养温度(无菌检验培养基最小检出量 *** 验证实验)

农村养殖畜牧网养殖技术 2023-08-04 08:12:165070

背景：兽药典规定无菌检验用培养基灵敏性验证时接种相应质控菌菌落数为1-50CFU，这个范围较广，不能精确的验证培养基的灵敏性，故为了更精确的对培养基进行验证，确定其最小检出量，特进行此 *** 验证。

名称	质控菌
流乙醇酸盐培养基（TG）	金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌
酪胨琼脂（GA）	金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌
葡萄糖蛋白胨（GP）	白色念珠球菌、黑曲霉菌

材料：

名称	厂家	批号	名称	来源	批号	活菌数	规格
流乙醇酸盐培养基（TG）	中海生物	150420	金黄色葡萄球菌	自制	201301	9.5*105CFU/ml	0.5ml/支
酪胨琼脂（GA）	中海生物	151123	铜绿假单胞菌	自制	201301	8*106 CFU/ml	0.5ml/支
葡萄糖蛋白胨（GP）	中海生物	151026	白色念珠球菌	自制	201301	1.6*104 CFU/ml	0.5ml/支
蛋白胨	OXOID	869398	生孢梭菌	自制	201301	8*104 CFU/ml	0.5ml/支
营养琼脂	中海生物	160229	/	/	/	/	/

/主要试剂配方

3.1 硫乙醇酸盐（TG）培养基：取培养基30g，加入1L MILLIPORE水，加热煮沸至完全溶解分装，116℃高压灭菌30min，于室温备用。

3.2 酪胨琼脂（GA）培养基：取培养基42g，加入1L MILLIPORE水，加热煮沸至完全溶解分装，116℃高压灭菌30min，于室温备用。

3.3葡萄糖蛋白胨（GP)培养基：取培养基28g，加入1L MILLIPORE水，加热煮沸至完全溶解分装，116℃高压灭菌30min，于室温备用。

3.4 半固体TG培养基：分别取TG培养基30g、GA培养基1g，加入1L MILLIPORE水，加热煮沸至完全溶解分装，116℃高压灭菌30min，于室温备用。

3.5 0.1%蛋白胨水：取1g胰蛋白胨，加入100ml MILLIPORE水，溶解后121℃ 灭菌15min，放置室温后，置2-8℃保存。

实验 ***

4.1 GA/TG培养基最小检出量实验

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌用0.1%蛋白胨水还原后，分别按照表3进行稀释，取理论菌落数为1CFU/0.2ml、5CFU/0.2ml、10CFU/0.2ml、15CFU/0.2ml、20CFU/0.2ml的稀释度,金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌每个稀释度分别接种TG、 6支，每支0.2ml,3支置25℃培养箱，另3支置37℃培养箱分别培养7日，每天观察小管污染情况并记录；金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌接种GA斜面6支，每支0.2ml,3支置25℃培养箱，另3支置37℃培养箱分别培养7日，每天观察小管污染情况并记录。

同时金黄色葡萄球菌每个稀释度接种2副营养琼脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。置37℃培养。

铜绿假单胞菌每个稀释度接种2副酪胨琼脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。置37℃培养。

生孢梭菌每个稀释度接种2管半固体TG培养基，每管0.2ml菌液,置37℃培养。

TG/GA小管配制日期：2016.03.21

接种日期：2016.03.23

表3 铜绿假单胞菌、生孢梭菌、金黄色葡萄球菌最小检出量验证稀释 ***

铜绿假单胞菌

管号

原瓶

①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

⑧

⑨

稀释液ml

1ml

4.5

7.4

加样量

取原瓶0.5

取①1

取②1

取③1

取④1

取⑤4

取④2

取⑤

取④1

取⑤2.5

取⑥1

CFU/ml

4*106

4*105

4*104

4*103

400（计数）

75（计数）

35（计数）

100

CFU/0.2ml

生孢梭菌

管号

原瓶

①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

⑧

⑨

稀释液ml

1ml

4.5

4.3

2.4

加样量

取原瓶0.5

取①1

取②1

取③1

取②1

取③4

取⑧1

CFU/ml

4*104

4*103

400

100

CFU/0.2ml

金黄色葡萄球菌

管号

原瓶

①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

⑧

⑨

稀释液ml

1ml

4.5

3.75

5.2

4.25

4.5

加样量

取原瓶0.5

取①0.5

取②0.5

取③1

取③0.5

取⑦2

取⑦0.5

CFU/ml

4.75*105

4.75*104

4.75*103

4.75*102

100

CFU/0.2ml

4.2 GP培养基最小检出量实验

将白色念珠球菌用0.1%蛋白胨水还原后，分别按照表4进行稀释，取理论菌落数为1CFU/0.2ml、2CFU/0.2ml、4CFU/0.2ml、5CFU/0.2ml、10CFU/0.2ml的稀释度，每个稀释度分别接种GP斜面 3支，每支0.2ml置25℃培养箱，每天观察小管污染情况并记录。同时每个稀释度接种2副酪胨琼脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。

GP小管配制时间：2016.04.08

检验日期：2016.04.09—2016.04.16

表4 白色念珠菌最小检出量验证稀释 ***

白色念珠菌	管号	原瓶	①	②	③	④	⑤	⑥	⑦	⑧
	稀释液ml	1ml	4.5	9	4.5	4.4	3	7	1.8	1.8
	加样量	/	取原瓶0.5	取①1	取②0.5	取②2	取②1	取②1	取③3	取②3
	CFU/ml	8000	800	80	8	25	20	10	5	50
	CFU/0.2ml	/	/	/	/	5	4	2	1	10
	接种管号	/	/	/	/	√	√	√	√	√

实验结果

5.1 硫乙醇酸盐培养基最小检出量的实验结果

按照4.1的实验 *** ，确定金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌在流乙醇酸盐培养基中的最小检出量，结果见表5、表6、表7。

表5 金黄色葡萄球菌在流乙醇酸盐培养基中的最小检出量

时间	最终接种菌数（CFU）
	1		5		10		15		20
	37℃	25℃	37℃	25℃	37℃	25℃	37℃	25℃	37℃	25℃
第1天（+）	3/3	0/3	3/3	0/3	3/3	0/3	3/3	0/3	3/3	0/3
第2天（+）	3/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
第3天（+）	3/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
第4天（+）	3/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
第5天（+）	3/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
第6天（+）	3/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
第7天（+）	3/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
培养结果	1/3		3/3		3/3		3/3		3/3
计数菌数（CFU)	1,0		3,4		12.18		16.16		20,22

表6铜绿假单胞菌和生孢梭菌在流乙醇酸盐培养基中的最小检出量

时间

生孢梭菌最终接种菌数（CFU）

铜绿假单胞菌最终接种菌数（CFU）

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

第1天（+）

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

1/3

0/3

2/3

0/3

3/3

1/3

3/3

0/3

3/3

0/3

第2天（+）

3/3

1/3

2/3

3/3

第3天（+）

3/3

1/3

2/3

3/3

第4天（+）

3/3

1/3

2/3

3/3

第5天（+）

3/3

1/3

2/3

3/3

第6天（+）

3/3

1/3

2/3

3/3

第7天（+）

3/3

1/3

2/3

3/3

培养结果

3/3

1/3

2/3

3/3

计数菌数（CFU)

2,2

9，10

26,24

0,0

6,4

2,2

4,8

结果表明：硫乙醇酸盐对金黄色葡萄球菌的最小检出量为3CFU、对生孢梭菌最小检出量为2CFU、对铜绿假单胞菌的最小检出量为2CFU。

备注：理论接种菌落数与同步计数菌落数有一定差异，结论以实际计数结果为准。

铜绿假单胞菌实际结果与计数结果差异较大，2次重复试验均如此。

5.2 酪胨琼脂培养基最小检出量的实验结果

按照4.1的实验 *** ，确定金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌在酪胨琼脂培养基中的最小检出量，结果见表7。

表7 金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在酪胨琼脂培养基中的最小检出量

时间

金黄色葡萄球菌最终接种菌数（CFU）

铜绿假单胞菌最终接种菌数（CFU）

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

第1天（+）

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

第2天（+）

2/3

1/3

3/3

2/3

3/3

1/3

0/3

3/3

2/3

3/3

第3天（+）

2/3

3/3

1/3

0/3

3/3

2/3

3/3

第4天（+）

2/3

3/3

1/3

0/3

3/3

2/3

3/3

第5天（+）

2/3

3/3

1/3

3/3

2/3

3/3

第6天（+）

2/3

3/3

1/3

3/3

2/3

3/3

第7天（+）

2/3

3/3

1/3

3/3

2/3

3/3

培养结果

2/3

3/3

1/3

2/3

3/3

计数菌数（CFU)

1,0

3,4

12.18

16.16

1,0

0,0

6,4

2,2

4,8

结果表明：酪胨琼脂培养基对金黄色葡萄球菌的最小检出量为3CFU、对铜绿假单胞菌的最小检出量为2CFU。

5.3 葡萄糖蛋白胨培养基最小检出量实验结果

按照4.2的实验 *** ，确定白色念珠球菌在酪胨琼脂培养基中的最小检出量，结果见表8。

表8 白色念珠菌在葡萄糖蛋白胨培养基中的最小检出量

时间	白色念珠菌最终接种菌数（CFU）
	1	2		4	5		10
	25℃		25℃	25℃		25℃	25℃
第1天（+）	0/3		0/3	0/3		0/3	0/3
第2天（+）	0/3		0/3	0/3		0/3	0/3
第3天（+）	1/3		3/3	3/3		3/3	3/3
第4天（+）	1/3		3/3	3/3		3/3	3/3
第5天（+）	1/3		3/3	3/3		3/3	3/3
第6天（+）	1/3		3/3	3/3		3/3	3/3
第7天（+）	1/3		3/3	3/3		3/3	3/3
观察结果	1/3		3/3	3/3		3/3	3/3
计数菌数（CFU)	0，0		0，0	1，0		1，1	3，3

结果表明：葡萄糖蛋白胨培养基对白色念珠球菌的最小检出量为1CFU。

结论与分析

1.理论接种菌落数与同步计数菌落数差异问题根据实验结果可以看出，理论接种菌落数与同步计数菌落数有一定差异，其中以铜绿假单胞菌差异更大。目前还未找到原因。因为同步计数菌落数比理论菌落数更加接近实际的菌落数，因此最小检出量以同步计数菌落数来计算。

2.最小检出量的管数判定问题在实验过程中，每个稀释度均接种3个对应的培养基小管，在培养结束后判定实验结果时，是按照3/3全部污染为标准。可是菌落数较少的稀释度并不是均不污染，而是污染2/3、1/3管。根据此现象，推测是因为细菌在样品中数量太少，而接种时只吸取0.2ml接种，若0.2ml里有菌落，则能够检出；若0.2ml里刚好没有吸到菌落则检不出来。因此，若认为每次接种均能够吸取菌落，则按照实验结果，则每一种培养基的最小检出量均为1个CFU。

名称	质控菌	3/3管最小检出量	2/3管最小检出量	1/3管最小检出量
流乙醇酸盐培养基（TG）	金黄色葡萄球菌	3CFU	/	1CFU
	铜绿假单胞菌	2CFU	1CFU	1CFU
	生孢梭菌	2CFU	/	/
酪胨琼脂（GA）	金黄色葡萄球菌	3CFU	/	1CFU
酪胨琼脂（GA）	铜绿假单胞菌	2CFU	1CFU	1CFU
葡萄糖蛋白胨（GP）	白色念珠球菌	1CFU	1CFU	1CFU