pcr 生物(一文读懂PCR技术在寄生虫检测中的应用)

农村养殖畜牧网养殖技术 2023-10-27 19:30:044610

诊断寄生虫学是动物疾病诊断领域的一门重要学科，是动物健康筛查不可或缺的组成部分。随着经典寄生虫学技术的发展，该学科在 20 世纪蓬勃发展，这些技术允许对寄生虫进行简单的检测，例如康奈尔-威斯康星州离心浮选技术。这些经过时间考验的技术的变体和修改仍然是许多诊断寄生虫学实验室的支柱。

虽然粪便样本中寄生虫生命阶段（例如，卵、包囊、卵囊）的形态学评估通常可以帮助识别与做出明智的临床治疗和控制决策相关的分类学水平（例如，物种、属、科），但经典的寄生虫学工具具有某些物种的明确鉴定的局限性。

分子技术可以提供急需的诊断解决方案，这对于有效的寄生虫病管理至关重要。许多血清学和分子测试，例如聚合酶链反应 (PCR)，目前正用于特定的寄生虫检测。这些测试在研究/学术环境中更为常见，但也可以通过商业诊断实验室提供。

寄生虫检测的基本 PCR ***

当形态学检测具有挑战性时，PCR 越来越多地用于确认寄生虫种类（框1）。有两种基本 *** ：物种特异性检测和通用检测。

框1 聚合酶链反应概述

01、它是什么？

聚合酶链反应 (PCR) 是一种用于选择性扩增（复制）双链 DNA 的特定部分的过程，该部分的侧翼序列是已知的。

02、它是如何工作的？

基本 PCR 包括 3 个步骤：

1. 模板 DNA 双链的变性

2. 引物与模板 DNA 的每条链的退火

3. 引物延伸以合成新的 DNA 链

在变性步骤中，模板 DNA 被加热到 94°C 以分离互补链。接下来，降低温度（通常为 50°C 至 65°C）使引物与模板 DNA 上的互补靶标重组或退火。退火温度由2个引物的解链温度(T m )决定。最后一步是延伸，在此期间 DNA 聚合酶使用反应混合物（PCR缓冲液、MgCl2）。延伸温度由特定的热稳定聚合酶决定，通常在 72°C 左右。使用热循环仪将反应混合物加热至特定温度并持续设定时间和设定数量的循环（35至45个循环）。亲本 DNA 模板以指数方式扩增，因此在 35 个 PCR 循环结束时，单个模板 DNA 可以扩增 350 亿次。

物种特异性 PCR 检测

物种特异性检测允许甚至从近亲中排他性检测寄生虫物种。对于这些测试，先前的研究已经确定一个感兴趣的寄生虫物种（例如物种 X）独有的 DNA 区域。然后设计特定引物以精确扩增该区域。使用这种 *** ，仅 PCR 扩增即可确认寄生虫鉴定为物种 X，并且不需要对 PCR 产物进行进一步测序。这反过来又缩短了这些检测的周转时间（通常在同一天）。

通用 PCR 检测

通用检测通常会扩增 DNA 的“可变区域”（每个寄生虫独有），其两侧是“保守区域”（所有相关物种都相同）。基于保守 DNA 区域的通用引物允许扩增所有相关物种的可变区。扩增的 PCR 产物被进一步测序并针对公开可用的数据库进行搜索，以确定寄生虫的身份。这种 *** 可以在单个 PCR 运行中识别感兴趣的寄生虫或其他密切相关的物种。

与物种特异性检测相比，这种 *** 的测序要求增加了通用检测的周转时间（2 到 5 天）。通用检测中最著名的 DNA 区域（标记物）是内部转录间隔区 (ITS)、细胞色素 c氧化酶 (CO) 和 18S 小亚基 rRNA 基因 (18S)。

何时使用 PCR

在诊断寄生虫学实验室中，PCR 战略性地用于补充传统技术，主要是为了解决后者的诊断局限性。适当使用分子技术进行最终寄生虫检测取决于区分形态相似物种的需要。

例如，在猫粪便样本的 *** 锌粪便浮选试验中观察到的9~13 × 7~9 µm 包囊（图 1）可以在形态学上鉴定为贾第鞭毛虫属。由于贾第鞭毛虫包囊无法区分，因此无法进一步识别 A 到 G 的物种或组合。猫可感染十二指肠贾第鞭毛虫组合 F 和/或组合 A，后者是人畜共患疾病。1基于为β-贾第虫基因座可变区侧翼的 2 个保守区设计的引物的 PCR 测试（即通用检测）通常用于区分贾第鞭毛虫组合。

图1

图2

相比之下，Dipylidium caninum（跳蚤绦虫；图2）的卵包在形态上不同，只有一种Dipylidium物种会感染狗。因此，在对狗粪便样本进行显微镜检查时识别出这个卵包应该可以确认是否感染了D 犬，不需要进一步的分子分析/确认。

何时使用物种特异性 PCR 检测

物种特异性 PCR 通常用于排除或排除目标寄生虫物种，尤其是在需要更快的周转时。例如，对感染绦虫的狗进行物种特异性 PCR，以确定是否存在多房棘球绦虫（一种人畜共患物种）。E multilocularis的卵（图 3)在形态上与绦虫科的其他成员无法区分；因此，对这些卵的形态学诊断可以将寄生虫鉴定为绦虫科，而不是属或种。但是，有关所有者希望诊断实验室能够迅速识别该物种。基于 NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢）脱氢酶亚基 1 基因 (ND1) 中独特核苷酸区域的物种特异性 PCR 检测已被证明具有 100% 的检测特异性。

图3

其他使用特异性 PCR 的例子包括识别狗血样中的犬恶丝虫（犬心丝虫）和猫粪便中的弓形虫。针对D immitis CO1基因区域的物种特异性 PCR 测定克服了对从视觉上区分心丝虫微丝蚴与其他寄生虫的专业知识的需求。同样，在猫粪便中脱落的刚地弓形虫（一种人畜共患的原生动物）的卵囊（图 4）类似于哈蒙氏弓形虫的卵囊，后者是一种鲜为人知的猫原生动物寄生虫。基于独特的 529 碱基对重复元素的特定 PCR 检测用于明确检测弓形虫。

图4

物种特异性 PCR 的缺点是它不能检测相关寄生虫的感染。尽管有这个限制，但诊断实验室更喜欢物种特异性 PCR 来满足特定要求。

何时使用通用 PCR 检测

如果目标是更全面的寄生虫检测而不是快速周转，那么通用检测就可以派上用场。对于上述多房绦虫的情况，如果拥有者可以确信检测多房绦虫科物种的诊断优势，则存在基于CO1基因的绦虫通用检测 *** 。该检测是从 CO1 进化上保守的区域设计的，该区域位于一个可变区域的两侧，其提供所需的分辨率来区分的属所有成员棘球绦虫（包括Ë细粒棘球绦虫和加拿大桉）和绦虫。同样，通用 PCR（基于18S基因）用于识别犬巴贝斯虫和狗血样中的犬巴贝斯虫。血液涂片检查无法区分这 2种大型巴贝虫，通用 PCR 检测更具决定性。

调查寄生虫学

尽管缺乏许多具有兽医重要性的寄生虫的完整 DNA 序列信息，但通用 PCR *** 已经为常见寄生虫生成了急需的 DNA 标记信息，这些信息可通过公开访问的序列数据库获得。这反过来又促进了通用 PCR 的使用，作为研究诊断寄生虫学的主要工具。

一般而言，寄生虫学家采用经典技能将寄生虫鉴定范围缩小到可能的更低分类水平，并在需要时采用通用 PCR 进行特定物种鉴定。例如，5 到 6 微米的卵囊（图 5）属于隐孢子虫属。然而，该属有超过 26 个有效种，大多数的卵囊在形态上无法区分。浮选试验和可用的隐孢子虫酶联免疫吸附试验 (ELISA)均无助于物种鉴定。狗可能感染C canis和/或C parvum，两者都具有人畜共患的可能性。有时，其他隐孢子虫的卵囊物种可能作为假寄生虫通过狗的肠道。如果未确定物种，则无法解决隐孢子虫传播给狗主人/饲养员的真正担忧。在这种情况下，基于18S基因位点的通用 PCR 检测可以提供必要的分辨率来区分每个种类的隐孢子虫。

图5

虚假寄生

PCR 已被有效地用于解决与伴侣动物有关的寄生虫诊断挑战，例如识别狗的假寄生；也就是说，在狗的粪便中发现狗不是合适宿主的寄生虫。狗以吃其他动物的粪便而臭名昭著。

未能识别假寄生可能会导致不必要的治疗。例如，在狗粪便中观察到约 60 × 40 µm 圆线虫型卵（图 6）通常被解释为感染了犬钩虫。事实上，如果狗吃了猫的粪便，并且将管形钩虫作为一种假寄生虫传播，那么就不可能进行物种的微观分化。从这些卵中提取 DNA 并对其进行通用 PCR 以扩增和测序 ITS-1 标记将确定寄生虫身份。同样，采用 ITS-2 PCR 将确定虚假的圆线虫类型的卵是反刍动物还是马来源。

图6A

图6B

PCR 测试的其他应用

PCR 还可用于识别/确认粪便中排空或从宿主中取出的大体寄生虫标本。例如，从狗的眼睛的前室取出的蠕虫通常被怀疑是吸吮线虫、恶丝虫或盘尾丝虫。如果样本不适合形态学，使用基于 NADH 脱氢酶亚基 5 基因 (ND5) 的通用 PCR 检测可能有助于在单次 PCR 运行中识别任何这些物种。

尸检时收集的样本也可以使用 PCR 进行检测。在这些情况下，病理学家经常寻求分子帮助来识别组织切片中的寄生虫，通常是为了确认属中的原生动物物种，例如肉孢子虫属、弓形虫属、新孢子虫属和哈蒙氏菌属，它们的组织阶段很难区分。如果通过组织学获得有关寄生虫更广泛分类的线索，则可以使用 PCR 识别许多常见寄生虫（包括蠕虫和节肢动物）。

PCR 检测的样本制备

寄生虫检测 PCR 的成功取决于各种因素，其中最重要的是用于初始 DNA 提取的样本。使用福尔马林等固定剂会削弱 DNA 链的解离，这是 PCR 扩增的必要步骤。因此，对于 PCR 测试，将粪便样本作为新鲜/冷藏和肉眼寄生虫在 70% 乙醇防腐剂中提交至关重要。福尔马林固定的寄生虫标本，包括石蜡包埋的组织卷，需要特殊的 DNA 提取方案，这可能会限制成功 PCR 所需的 DNA 质量。

PCR 的局限性

目前，分子寄生虫检测不被认为是经典检测的替代方案。虽然在少数情况下用于诊断犬的先天性感染，但主要用作通过来自寄生虫阶段的 DNA 检测未发性寄生虫感染的确认试验。采用分子寄生虫学诊断的障碍很多。开发分子检测作为寄生虫检测的唯一诊断工具需要繁琐的验证过程，这超出了许多诊断寄生虫学实验室的范围和范围。更重要的是，过度诊断的风险迫在眉睫。例如，一项研究发现了弓形虫的PCR 证据没有活动性肠道感染的猫粪便中的 DNA；存在感染了寄生虫“-zoite”阶段的猎物，作为 DNA 的来源。必须谨慎解释此类结果。