导读
文章旨在研究断奶日龄对仔猪的天然免疫和皮质醇的短期及长期影响。对72头（来自12窝）杂交白毛仔猪随机分成2组断奶，断奶日龄分别为14d和28d，2组仔猪断奶后仍保留在原窝饲养至20周龄。分别在断奶前（记为d0）、断奶后第1、7、14天（短期）及断奶后8、12、16、20周（长期）对所有仔猪进行血样采集。结果表明，断奶日龄对仔猪的短期和长期的（断奶）应激反应均有显著影响，也会影响仔猪的白细胞群体数量和天然免疫功能。
断奶日龄对于仔猪的免疫系统和皮质醇都有影响，不同断奶日龄产生不同的后果。刚断奶的仔猪，尤其是那些在20日龄前断奶的仔猪，更易于感染疾病。16或18日龄断奶的仔猪比20日龄断奶的仔猪更容易暴发大肠杆菌引起的腹泻。早期断奶仔猪的中性粒细胞（N）与淋巴细胞（L）的比率（N∶L）的升高预示着急性应激、免疫力下降和细胞因子的产生，而21日龄断奶仔猪的皮质醇升高，淋巴细胞增殖减少。但也有一些研究发现断奶日龄对仔猪的免疫系统（包括适应性免疫能力）没有影响。然而，研究表明，随着断奶日龄的增加，由于免疫系统的不断完善，白细胞群从14日龄时主要参与天然免疫功能的白细胞为主转到21日龄和28日龄主要参与适应性免疫功能的白细胞为主，这意味着断奶日龄对仔猪的内分泌和免疫状态有短期影响。关于断奶日龄对断奶后仔猪免疫应答的影响的科学资料很少。因此，文章研究的目的是确定和描述断奶日龄对仔猪应激反应和免疫状态的短期和长期影响。
材料和 ***
1.1试验动物和试验设计
试验仔猪产自于伊利诺伊大学（UniversityofIllinois）厄巴纳研究农场的经产杂交白毛母猪。试验仔猪共72头，分成12窝，每窝6头（3头公阉猪、3头母仔猪），随机分入14日龄或28日龄断奶组。到指定日龄时，每窝3头公阉猪和3头母仔猪被随机分配到机械通风和环境良好的猪圈舍内饲养至20周龄。同性别内试验仔猪体重相近且对所有仔猪均以达到或超过推荐的营养标准（NRC，2000）饲喂，每圈都配备了一个杯状饮水器。
1.2血样采集
2个断奶日龄组分别于断奶后第1、7、14天以及8、12、16、20周龄时采集血样。使用含有肝素钠的真空容器通过前腔静脉穿刺收集血液样本并将所采血液样本立即置于冰上。饲养至8周龄时开始采血，将猪置于仰卧位采血（采血过程≤1min），12周龄时，将猪保定，站立时取样（采血过程≤2min）。
1.3细胞的分离和计数
将肝素处理的全血（10μL）加入Isoflow（10mL;BeckmanCoulter,Miami,FL），红细胞被溶解，用CoulterZ1粒子计数器（BeckmanCoulter）自动测定总白细胞数。光学显微镜下对白细胞进行人工分离和计数以确定各种白细胞数量的百分比。全血用RPMI（RoswellParkMemorialInstitute）溶解液（Gibco,Carl *** ad,CA）稀释，中性粒细胞分离液（Hisptopaque-1077）（密度：1.077g/mL；Sigma）和Hisptopaque-1119（密度：1.119g/mL；Sigma）进行分层，在25˚C，700×g下离心30min。从Hisptopaque-1077层收集淋巴细胞，在RPMI中洗涤2次再悬浮，并计数。从Hisptopaque-1119层中除去中性粒细胞和红细胞，在RPMI中冲洗1次，用低温无内毒素水溶解红细胞，用10×PBS恢复其等渗性。中性粒细胞在475×g下离心10min，取上清液，洗涤2次，再悬浮于RPMI中。根据免疫分析的要求，用RPMI调节细胞浓度。
1.4免疫分析
自然杀伤细胞（NK）的细胞毒性是使用购买的非放射性细胞毒性检测试剂盒（罗氏诊断，印第安纳波利斯，IN）测量的。简言之，猪淋巴细胞被用作效应细胞，K-562慢性人骨髓源性白血病细胞（美国组织型培养物，Manassas，VA）作为靶细胞。淋巴细胞（浓度）调到1×107个/mL，K562细胞调至10000个/孔。分析样品设置3个重复和4个处理〔效应器（淋巴细胞）：靶细胞（K-562）分别为12.5∶1、25∶1、50∶1和100∶1〕。用微型平板阅读器（BIO-TEK仪器）在490nm波长和690nm的参考波长下读取结果。如果更大释放数除以自发释放数≤20%，分析结果认为有效。中性粒细胞趋化性采用之前描述的测定 *** 测定。简单说就是用浓度为3×106个/mL的中性粒细胞，评估中性粒细胞迁移至分析培养基（对照组；随机迁移）或重组人补体-5a（hc5a；10−7m；Sigma）（趋化性测试组；定向迁移）的能力。中性粒细胞吞噬功能采用以前所描述的 *** （略有修改）使用流式细胞仪测定的。荧光珠与非热灭活猪血清孵育30min后，按10∶1（珠粒/中性粒细胞）比例添加到样品中。细胞和珠粒被一起孵育45min，然后通过流式细胞仪评估细胞吞噬荧光颗粒的百分比。
1.5血浆分析
血浆总免疫球蛋白（IgG）用ELISA法测定，如Niekamp等在2007年所述。用0.05%Tween-PBS活性剂稀释猪血浆样品至1∶3000。在96孔微孔滴定板上分别滴入120μL稀释样品或标准品，涂上一层猪IgG（JacksonImmunoresearch,WestGrove,PA）。兔抗猪IgG（120μL；Sigma，St.Louis，MO），在25˚C下孵育2h，然后用0.05%Tween-PBS活性剂洗涤3次。加入酶联抗兔IgG（200μL；JacksonImmunoresearch），稀释倍数为1∶7500，平板孵育1h，倒去液体后再洗3次。加入底物溶液（200μL；1mg/mL对硝基苯磷酸酯；Sigma），30min后，用2M的100μLNaOH停止反应。用微型平板阅读器（BioTekInstruments,Winooski,VT）在405nm波长读取平板，用标准曲线（0，0.1，0.5，1，5，10，20，40μg/mL）测定血浆总IgG。血浆皮质醇的测定是用购买的里亚试剂包（RIAkit）(Coat-A-Count;DiagnosticProducts,LosAngeles,CA）对猪样品进行的，组内和组间变异系数分别为7.0%和13.5%，更低可检测浓度为2ng/mL。
1.6统计分析
使用SAS进行统计分析（SAS，2012）。检验数据是否偏离正态分布，对所有偏离正态分布的数据进行自然对数变换。采用线性混合效应模型，分析跨断奶日龄的所有变量，包括保育和育肥期重复的仔猪变量以及日龄对仔猪BW的影响。模型的固定因素为2个断奶日龄处理（14和28日龄）、断奶时间（d0、第1、7、14天和8、12、16、20周龄）和性别（母仔猪和 *** 公仔猪）。随机因素包括窝和圈。拟合了具有协方差结构的重复测度模型以解释猪内重复测定变量的性质。分别用SAS程序的Means和estimate *** 比较不同时间点和2个断奶日龄在每个时间节点的影响。显著性设定为P≤0.05。
（实验结果见下期）
