文|渔事农谈

编辑|渔事农谈

1.介绍

表达K88+(F4)菌毛的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)感染是猪断奶后腹泻的最重要原因之一，造成重大经济损失。这些损失是由于生产性能下降、肠道健康受损、对疾病的易感性增加以及死亡率高造成的。

研究表明，粘附在上皮上的ETEC在猪小肠中的定植是新生儿和断奶后仔猪大多数胃肠道疾病的原因。随着时间的推移，这一挑战已通过在饲料中添加抗微生物生长促进剂(AGP)来解决。

在畜牧业中，抗微生物药物不仅以亚治疗剂量用于促进生长，而且还用于疾病预防(预防剂量)和治疗(治疗剂量)。此外，许多报告已经证明了抗菌剂对提高动物生产性能的重大贡献。

然而，由于食用动物产品中的抗菌药物残留和抗生素耐药细菌的增加，人们对抗菌药物的使用感到担忧。

因此，公众压力越来越大，要求在牲畜日粮中停止使用饲用抗生素作为AGP，因此需要确定有效可行的AGP替代疗法。

任何AGP的替代品都必须在性能和饲料效率方面提供经济上可行的改进，并且必须确定候选替代品的组合。其中一种替代疗法是壳寡糖和粪肠球菌益生菌的组合，因为它们可能具有协同作用。

此外，这两种添加剂之间的增强效果有望保护早期断奶仔猪免受ETECK88+感染的有害影响。

2.材料与 ***

2.1.动物，治疗和口腔挑战

本研究选用30头21±1日龄断奶仔猪([约克郡长]杜洛克，初始体重为7.19±0.52 kg)，来自曼尼托巴大学格伦利亚猪研究中心。

在加拿大温尼伯马尼托巴大学动物科学研究中心进行的为期14天的试验中，猪被单独饲养在房间内的笼子(尺寸:76厘米×61厘米×38厘米)中。

饲料和水是免费提供的，适应期7天后，称量猪体重，采血(颈静脉穿刺)测定血浆尿素氮(PUN)含量。随后，每头猪口服6 mL (1×10 11 cfu/mL)新鲜生长的ETEC接种物。

测定周体重和采食量，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和体重增重与采食量之比。攻毒后7 d对猪进行腹泻发生率、采食量、体重增重和一般健康状况的监测。

腹泻的发生率和严重程度由2名训练有素的独立人员(不了解饮食处理分配)在笼子基础上(以动物为单位)进行评估，使用粪便一致性评分系统(0/4正常粪便;1/4软粪;2/4轻度腹泻;3/4严重腹泻)。

每头仔猪的粪便稠度通过平均分配分数来确定，得分1被认为没有腹泻。

2.2.益生菌菌株的分离、鉴定及微胶囊化

微囊化PRO由中国北京国家粮食局研究院制备并获得。总之，通过选择性培养，从人类婴儿肠球菌、猪肠球菌和肉鸡肠球菌 *** 获得63株潜在益生菌菌株。

其中13株经Biolog自动微量分析系统和16S rRNA基因测序鉴定为粪肠球菌或粪肠球菌。选取粪肠杆菌CG1.0007菌株，根据其生长和代谢性能、对致病菌的抑制和对不利条件的抗性进行分离。

该菌株生长速度快(生成时间约20 min)，滞后期短(1.5小时)， L-乳酸产量高(可达8 g/L)，并具有抑制常见致病菌的能力。

2.3.ETEC K88+和培养条件

ETEC K88+菌株最初来自加拿大马尼托巴省温尼伯市马尼托巴省兽医诊断服务中心。从冷冻的高液中，将ETEC K88+在脑心脏灌注(BHI)琼脂上划线，并在37℃厌氧培养过夜。

然后将单个菌落接种在2个BHI板上(即重复)，在37 C厌氧孵育过夜。从单个菌落中接种两管5ml BHI肉汤加2% ，在37℃下摇摇(200rpm)培养过夜。

使用乳胶凝集试剂盒验证身份。从5ml培养管中取2ml大肠杆菌接种两个500ml 肉汁加2%的烧瓶，然后在37℃下摇摇(200rpm)厌氧孵育过夜。

两个500ml的烧瓶混合均匀。将培养物在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中连续稀释10倍，在BHI板上涂106至109稀释物，检查培养物>1×10 9。37℃厌氧培养过夜。

第二天计数稀释板上的菌落，测定浓度。接种量为每头仔猪1×10 11 cfu/mL，接种量为6 mL。

2.4.血样采集

在大肠杆菌口服接种前的第8天、大肠杆菌攻毒后的第24和48小时(研究的第9和第10天)，从每头仔猪的颈静脉采集肝素化血样，以获得血浆用于双环己烷浓度分析。

样品立即在5℃下3000×g离心15分钟，收集血浆，并保存在20℃，直到需要进行PUN分析。

2.5.肠组织收集

在肌内注射 *** 和噻嗪，并通过心脏内注射戊巴比妥钠。

从头到回盲交界处的15厘米处，从每头仔猪上收集2厘米的回肠切片，保存在10%福尔马林中，固定绒毛和隐窝，用于随后的组织形态学测量。

采用标准苏木精和伊红(H&E)法对福尔马林固定样品的横截面进行组织学检查。使用配有索尼3芯片CCD彩色相机的蔡司显微镜，在每个标本上至少10个定向良好的绒毛上测量绒毛高度(VH)和隐窝深度(CD)。

使用Image J分析捕获的图像，测量绒毛从尖端到绒毛-隐窝连接处的高度，以及从该连接处到基部的隐窝深度，并确定绒毛-隐窝比(VH:CD)。

2.6.样品制备和化学分析

在化学分析之前，实验饲料被磨碎并通过1毫米的筛网。对饲料样品进行干物质、粗蛋白质、总能、钙和磷的分析。

根据AOAC(1990)测定干物质含量，将5g样品在102 ℃下烘箱干燥过夜。总能量使用绝热弹量热计测量，以苯甲酸为标准进行校准。

氮含量的测定采用燃烧法，粗蛋白质计算为氮6.25。用于分析Ca和P的样品 *** 燥12小时，并在电感耦合等离子体质谱仪上读取。

3.结果

3.1.血浆尿素氮

攻毒前后24和48 h，不同饲粮处理的双关浓度无差异。然而，在接种24小时后，无论饮食处理如何，浓度都比基线值有所增加(表3)。

3.2.腹泻情况

在试验前未观察到腹泻(表4)。然而，NC组和pro组各有2头仔猪(33%)出现轻度腹泻，COS组和CPRO组各有1头仔猪(17%)出现腹泻(表3)。

PC组仔猪未出现腹泻。攻毒后1 d, NC组有4头(67%)仔猪出现严重腹泻，而CPRO组3头(50%)、PRO组2头(33%)、PC组和cos组各1头(17%)仔猪出现轻度腹泻。

攻毒后3天, NC组有3头仔猪(50%)出现严重腹泻，PRO组和CPRO组各有1头仔猪(17%)出现轻度腹泻，PC组和COS组仔猪均无腹泻。

5种饲料处理的腹泻发生率和严重程度无统计学差异(P > 0.10)。

4.讨论

本研究中使用的ETEC K88+口腔攻毒模型不够敏感，无法在与断奶后大肠杆菌病临床病例相似的攻毒仔猪中产生应答。

不同处理之间的最终体重相似，在etec K88+ *** 前后，饲粮中添加COS、PRO或CPRO对生长性能的影响相似。

然而，CPRO饲粮的G:F更高，且与NC饲粮差异显著，说明COS与PRO组合可提高养分利用效率。

尽管壳聚糖对肉鸡、猪或其他牲畜生长性能的影响并不一致，但其日粮添加已被证明支持肉鸡优越的生长性能和饲料转化率和提高猪的生长率。

添加壳聚糖对猪的积极影响归因于采食量的增加，营养物质表观消化率的提高，降低腹泻发生率，改善小肠形态。然而，应该指出的是，关于日粮中添加壳聚糖对家禽和猪的影响，已有相互矛盾的观察报告。

例如，与饲喂对照日粮的肉鸡相比，饲喂30 g/kg壳聚糖的肉鸡体重和采食量显著减少。

壳聚糖对肠道健康的积极影响可能与它对致病微生物的抗菌活性有关，特别是对革兰氏阴性菌，如大肠杆菌。壳聚糖与细菌细胞壁和细胞膜的静电相互作用。

这会导致细胞壁保护丧失和细胞膜暴露，导致细胞膜通透性急剧增加，最终导致细胞死亡。因此，在本研究中，预计饲粮中添加COS将对ETEC感染猪的肠道健康产生类似的益处。

然而，根据本研究的结果，在挑战前或挑战后期间，情况并非如此。这一观察结果可能归因于观察到的采食量减少。

日粮中添加壳聚糖可以通过增加采食量来改善仔猪的生长性能。壳聚糖对革兰氏阳性菌(如粪肠杆菌)的抗菌作用可以部分解释壳聚糖对粪肠杆菌(本研究中用作益生菌)的抗菌作用。

尽管如此，据报道，这种抑 *** 用对革兰氏阴性菌更为明显，因为革兰氏阴性菌的细胞壁上具有更高的负电荷(多阴离子)，并且吸附了更多的壳聚糖。

革兰氏阳性菌的细胞壁由肽聚糖和磷壁酸组成。壁苔酸是细胞壁必需的聚阴离子聚合物，穿过细胞壁与肽聚糖层接触。

壳聚糖与细胞表面通过静电相互作用与壁苔酸连接，使壳聚糖干扰膜功能，并随后导致细胞死亡。

虽然在仔猪饲粮中单独添加PRO并不能显著提高仔猪的生长性能，但从数值上看，益生菌仔猪的生长性能优于COS仔猪。这可能表明COS和PRO之间没有协同作用，因此对生长性能响应标准的影响不显著。

5.结论

在本研究条件下，仔猪饲粮中添加400 mg/kg COS、100 mg/kg微囊化PRO或其组合在etec k88 +口服接种前后均未显著提高仔猪的生长性能。

同样，与对照组相比，攻毒后早期断奶仔猪腹泻的发生率和严重程度也没有降低。然而，本研究结果可用于收集大数据来预测壳聚糖的添加量及其组合。

6.参考文献

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4. Canadian Council of Animal Care. 实验动物的护理和使用指南. 2nd ed., vol. 1. Ottawa, ON: CCAC; 2009.
5. Chen YJ, Kim IH, Cho JH, Yoo *** , Wang Y, Huang Y, et al .添加壳寡糖对断奶仔猪生长性能、营养物质消化率、血液特性和免疫反应的影响. Livest Sci 2009;124:255-60.