引言
生物分析通常指在动物和人体的体液或组织中对生物药进行定量测定，包括单抗、细胞因子、生长素、融合蛋白等的浓度。绝大多数生物药的生物分析 *** 都基于免疫测试 *** （Immunoassays）。ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫分析法）是一种常用的生物分析 *** ，其利用抗原或抗体吸附在固相载体表面，结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，通过抗原抗体特异性结合，加入酶标记的抗原或抗体进行定性或定量分析。
ELISA法的基本类型
ELISA可分为均相（homogenous）和非均相（heterogenous）两种类型。非均相酶联免疫分析法是比较常用的 *** 。根据固相载体区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即通常所指的ELISA（微量板ELISA）；一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA，称为斑点ELISA（Dot-ELISA）；一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA（C-ELISA）。
常见的ELISA格式根据其性质不同分为直接ELISA法、间接ELISA、双抗夹心ELISA、竞争ELISA法，图1展示了4种ELISA测试格式。
图1 直接ELISA法、间接ELISA法、双抗夹心法、竞争ELISA法测试格式
ELISA法在生物制药领域的应用
PK（PharmacoKinetics）检测
PK是药物研发过程中重要的组成部分，在早期阶段可能无法得到mAbs或pAbs，通常选择重组配体（即治疗靶点）作为关键试剂来测定游离治疗蛋白(free therapeutic protein, TP)浓度。虽然该 *** 仅能测定（结合靶标后的TP 和游离的TPf）总浓度，但是在早期临床研究中，对于有Fc部分的抗体，仍会选用ELISA进行药物的PK检测，
生物标志物
与PK *** 相似，生物标志物法可以用于测量预期基质中生物标志物蛋白的游离或总浓度。生物标志物通常会采用配体结合 *** （LBA）或者LC-MS/MS *** 进行检测。由于生物基质中进行检测的生物标志物大部分是大分子的蛋白或者多肽，LBA的 *** 运用的更为广泛。夹心法测试格式是主要选择，通常用于测量游离或总浓度的生物标志物。
免疫原性检测
在早期临床前试验系统中，治疗性蛋白药物如人源化/全人源单克隆抗体或重组蛋白，可诱导形成抗药物抗体。药物诱导形成的抗体通常被称为抗药物抗体（ADA），免疫原性检测是检测ADA是否存在于血清中的之一级分析。ADA可与血液循环中的药物形成复合物，高浓度的治疗蛋白药物会干扰ADA检测。对生物类似药与创新药以及抗体-药物偶联物来讲，都大大增加了生物分析方面的挑战和免疫原性评估的复杂性。
表1 ELISA法在PK/生物标记/免疫原性测试方面常用试剂与测试格式
ELISA *** 学建立考量点
首先明确ELISA *** 开发的目的，如果是进行大分子定量，包被的抗原远远过量是 *** 稳定的必然选择；如果是进行ELISA的亲和力分析，包被的抗原少量是 *** 稳定的必然选择。
其次是做好平台的搭建工作，如关键试剂的选择和稳定性、测试格式的选择（抗体、稀释液、微孔板、检测系统等）、标准曲线模型的选择、样本基质的选择、试剂的特异性、样本制备等需要 *** 开发初期进行摸索，评估 *** 的稳健性（robustness）。
同时开发出来的 *** 需要进行 *** 学验证，生物学活性测定 *** 验证的目的就是要对引起实验结果变异和偏差的各种因素进行评价，以确定实验 *** 的可靠性和可行性，应考虑生物学活性测定 *** 的特点：
（1）生物学活性是相对活性，必须对单位有一个适当的定义或以有关机构颁布的标品或参考品作为对照。
（2）样品和标准品的剂量反应曲线必须是平行的，即样品和标准品除了有效活性不同之外，必须是相同的。
（3）应对 *** 的变异性进行统计学分析，以确定生物学活性可接受的有效范围。效价测定的变异来源因素有:单次试验的变异性；在同一天试验的变异；不同实验日造成变异；不同实验者造成的变异；不同分析 *** 造成的变异；不同实验室引起的变异。应对这些变异因素进行综合分析。
（4）应对引起系统偏差的某些因素进行综合分析：不同的实验平板；在平板的不同位置（边缘效应）；检测次序（加样先后）。
96孔板测定生物学活性实验设计举例
采用96孔板测定生物学活性是活性检测常用手段，一致性实验就是在96孔板上所有的孔都加入相同浓度的所有试剂，包括已知浓度的活性参考品，考察各种因素对检测结果的影响。其中主要考虑以下几点因素：
(1)位置效应的影响：位于板上不同位置的样品对检测结果的影响。
(2)序列稀释随机化影响:多通道加样器实际上很难使样品浓度及板上的位置完全随机化。
表2和表3分别展示两种考察位置效应和序列随机化考量因素的实验设计案例，其中表2（分段设计）将样品随机分配至行、浓度至列，表3（分区设计）样品和浓度特异组合形成一个区域，两种实验设计可排除位置因素和序列稀释因素对检测结果的影响，多个维度考察，评估实验 *** 建立的稳健性。
表2 分段设计生物测定96孔板的一种可能安排
X为不用的孔，+为阳性对照，-为阴性对照，A/B/C/D/E为待测样品；R为参考品；1-10分别代表不同稀释度
表3 分区设计生物测定96孔板上一种可能安排
X为不用的孔，+为阳性对照，-为阴性对照，A/B/C为待测样品；R为参考品；1-8分别代表不同稀释度
总之，生物技术产品的检测由于其特有的生物测定变异性，不同的测定 *** 和反应原理在验证时应根据具体情况进行不同参数的测定，有时还需要考察样品保存条件、处理 *** 等因素对测定结果的影响。
结语
以上是关于ELISA简介与应用，以及活性检测 *** 建立过程中需要考量的要点描述，良好的 *** 验证对于评价生物技术药物质量具有至关重要的意义,验证 *** 的科学性反映了采用该 *** 进行检测结果的可靠性。 *** 学的验证可以参考2020版中国药典四部9012《生物样品定量分析 *** 验证指导原则》、9401《生物制品生物活性/效价测定 *** 验证指导原则》以及USP<1032>、<1033>、<1034>里面有较详细的生物活性 *** 验证方案设计、结果统计学分析的案例。熟悉ELISA原理对于生物学活性的开发和评价具有重要的指导意义。
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