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铜作为动物生长繁殖过程中必不可少的微量元素，是动物体内多种蛋白酶的辅助因子，以酶激活剂的形式来影响动物体的消化吸收、免疫应激等生理功能，动物日粮中添加铜能促进其胰岛素生长因子、生长激素等各类激素的分泌，提高动物的生产性能。

另一方面，铜也具有双向作用，动物机体缺铜会导致骨骼发育不全，抗氧化酶活性降低，生长速度受限等，而动物体铜元素摄入过多时，会导致机体产生铜中毒反应，造成肝脏损伤，此外，动物体采食高铜饲粮还会导致其排泄物中的铜元素含量显著上升，造成环境重金属污染，高铜饲粮的营养供给也会导致铜在动物体畜产品中沉积之后经食物链传递至人类餐桌，进而威胁到人类生命健康。

因此，在现代集约化养殖条件之下，找到一种能减少动物日粮中铜添加水平的 *** 具有十分重要的意义。

目前，国内外关于微生态制剂的研究已有大量报道。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BS）因具有较强的抗逆性，在生物体胃肠道中能稳定地存在、定植，其分泌物能有效抑制肠道中的致病菌，近年来已成为微生态制剂里的研究热点。

有研究指出，BS菌体表面带有的特殊基团在一定条件下对Cu+特异点吸附作用，能提高动物的肉品质以及消化吸收能力。

截止目前，关于铜及BS对动物生长、繁殖影响效果及其作用机制研究较多，而饲粮中添加BS对畜禽微量元素利用效率的影响研究还鲜有报道，铜与BS协同对产蛋期种鹅机体肠道组织发育及肠道微生物菌群的研究还处于空白。

因此，本试验以46~56周龄的五龙鹅为研究对象，通过研究不同铜水平饲粮中添加不同水平的BS对其生长性能、空肠组织发育和盲肠微生物菌群结构的影响，以探索产蛋期种鹅饲粮中在适宜枯草芽孢杆菌添加条件下铜更低添加水平，为低排放生态营养技术提供数据支撑。

材料与 ***

试验设计

本研究开展于2018年6月—2018年9月，采用2×3因子试验设计，选择46周龄体况相近的五龙鹅产蛋期种鹅120只，随机分为6组，每组4个重复，每个重复5只（1公4母），试验用铜源为有效成分为98.5%的五水 *** 铜，购自浙江新维普添加剂有限公司，试验用BS活菌数为2×109 CFU/g，购自山东苏柯汉生物工程股份有限公司。

Ⅰ~Ⅲ组的铜添加水平为2、4、6 mg/kg，BS添加水平为125mg/kg，Ⅳ~Ⅵ组的铜添加水平为2、4、6 mg/kg，BS添加水平为250 mg/kg。

试验鹅基础日粮以玉米和豆粕为主要原料，参照NRC（1994）种鹅饲养标准配制。

饲养周期为46~56周龄。

基础饲粮组成及营养水平（风干基础） %

测定指标及 ***

正试期开始每天08:00捡蛋，每天记录产蛋数、合格蛋数及耗料量、蛋重，计算产蛋率（Laying Rait，LR）、料蛋比（Food to Egg Ratio，FER）、平均日采食量（Average Daily Feed Intake，ADFI）；于试验期第10周末每个重复随机挑取1只种鹅，放血致死后迅速剖开腹腔，无菌操作取出盲肠，迅速收集到冻存管液氮保存，转移到-80℃冰箱保存待测。

在屠宰试验进行时，取鹅的全部小肠，液氮冷冻保存。

然后取每个小肠的空肠部分，去除空肠内容物后用0.9%的生理盐清洗，取下肠段表面的食糜，保存在10%含量的甲醛溶液中用于组织切片的 *** 。

组织样品处理：将甲醛中的样本进行修整、冲水、样本脱水、透明处理、浸泡石蜡、包埋样本、切片机切片、整理展开切片、苏木精-伊红（HE）染色、样本封片等石蜡切片 *** 程序。

在O *** MPUS系统显微镜10×10镜下观察， *** -WN-HP SUPPER CCD软件测量空肠的绒毛高度（Villus Height，VH）、隐窝深度（Crypt Depth，CD），计算绒隐比（VH/CD，V/C）。

盲肠微生物总DNA的提取

对每个样品进行单独测定，采用天根生化科技有限公司的基因组DNA试剂盒提取出盲肠基因组DNA。

盲肠微生物总DNA的定量和纯度检测

DNA含量用DNA定量仪进行测定，DNA纯度用OD260/OD280进行表述，同时用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小。

PCR扩增及细菌16S rDNA测序分析

按照细菌16S rRNA（V3+V4）区域合成引物5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。

样品检测时PCR预试验的程序如下：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，共25个循环。

统计分析

利用试验数据采用SAS 8.0线性模型双因素方差分析（Two-way ANOVA），不同处理组间采用Duncan's多重比较进行显著性检验，P<0.05视为具有统计学意义的差异。

将优化序列进行聚类，划分OTU，并根据OTU的序列组成得到其物种分类，基于OTU分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样品在门、纲、目、科、属、种分类学水平上的群落结构图。

通过Alpha多样性统计各样品在97%相似度水平下的Ace、Chao1、Shannon及Simpson指数比较各组之间微生物区系的丰富度、物种差异性以及多样性。

结果与分析

铜与BS协同产蛋期种鹅生产性能及空肠形态的影响

不同水平的铜与枯草芽孢杆菌协同对种鹅的ADFI、LR、FER影响不显著。

饲粮中BS对生产性能无显著影响，饲粮中Cu对种鹅生产性能无显著影响。

饲粮中添加不同水平铜和BS协同对产蛋期种鹅的VH影响显著，对种鹅CD、V/C影响极显著。

饲粮中铜对VH、V/C有极显著影响，对CD有显著影响；饲粮中BS对VH、CD、V/C有极显著影响。

两者协同时，Ⅳ、Ⅴ组的VH高于其他各组（P<0.05）；Ⅴ组的CD低于Ⅲ组（P<0.05）及Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ组（P<0.01）；Ⅳ、Ⅴ组的V/C高于Ⅱ、Ⅲ组（P<0.05）及Ⅰ、Ⅵ组（P<0.01）。

结果表明，铜和BS在Ⅳ、Ⅴ组的协同效果更好，即BS添加250 mg/kg，铜添加2~4 mg/kg时效果更好，显著改善了产蛋期种鹅肠道组织形态。

铜与BS协同对种鹅生产性能的影响

注：同列数据肩标不同小写字母代表差异显著（P<0.05）。

1表示4个重复的平均值；2表示8个重复的平均值；3表示12个重复的平均值。

铜与BS协同对产蛋期种鹅空肠的影响

铜与BS协同对产蛋期种鹅盲肠微生物菌群的影响

盲肠肠道微生物菌群分析

试验样品测序共获得1 862 928对Reads，双端Reads拼接，过滤后共产生1 503 439条Clean Tags，平均每个试验样品产生62 643条Clean Tags，过滤掉嵌合体后的有效嵌合体数Effective Tags是1 448 129条，平均每个样品产生60 341条Effective Tags。

盲肠肠道菌群结构分析

使用Mothur（version v.1.30）软件对样品Alpha多样性指数进行评估。

为比较样品之间的多样性指数，在分析期间将样品中包含的序列数归一化。

在97%的相似性水平下，每个样品的α多样性的数值统计显示在表4中。

Ⅲ组的OTU值为更大375个，Simpson指数最小0.027 1，Shannon指数更大4.449 6，说明Ⅲ组的物种多样性更高，均匀度更好。

Ⅱ组的OTU数值为291，Simpson指数更大为0.061 7，Shannon指数最小为3.798 1，表明Ⅱ组的肠道微生物多样性更低，均匀度最差。

剩余Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的OTU数值都是介于Ⅱ、Ⅲ组之间，其物种多样性按大小排序为Ⅴ组>Ⅵ组>Ⅳ组>Ⅰ组；试验样品的OTU统计覆盖率深度指数值Coverage，Ⅰ~Ⅵ组均大于0.999。

表明试验样本中物种被测出的概率极高，样本结果代表了样本中微生物的真实情况；此外，也表明不同水平的铜和BS协同在一定水平上能影响产蛋期种鹅盲肠微生物菌群的组成，优化盲肠益生菌菌群结构。

铜与BS协同对产蛋期种鹅盲肠微生物菌群多样性的影响

注：Coverage是样本文库的覆盖率。

产蛋期种鹅盲肠优势菌群分析

盲肠菌群门水平丰度的影响

在相似性97%的门水平下，不同水平的铜与BS协同对种鹅盲肠的厚壁、拟杆、变形、放线菌门等无显著影响。

饲粮中铜对种鹅盲肠的厚壁菌门影响显著，4 mg/kg组的厚壁菌门低于6 mg/kg（P<0.05）。

在微生物丰度排名前十，丰富比例高于0.1%，且在相似性97%的门水平下，所有样品共检测到12个不同个菌门，Ⅵ组检测到10个菌门，Ⅰ、Ⅳ组检测到11个菌门，剩余各组检测到12个菌门。

其中厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）为主要的优势菌门。

Ⅵ组的厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度为66.34%，显著高于剩余各组。

Ⅱ、Ⅴ组的拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度分别为37.83%和38.65%，显著高于剩余各组。

Ⅰ组的变形菌门（Proteobacteria）相对丰度为1.93%，显著低于Ⅱ~Ⅵ组。

Ⅳ、Ⅴ组的、放线菌门（Actinobacteria）相对丰富分别为1.05%和2.53%，显著低于剩余各组。

门水平优势菌群多样性分析 %

产蛋期种鹅盲肠菌群纲水平丰度的影响

在相似性97%的纲水平下，不同水平的铜与BS协同对产蛋期种鹅盲肠的梭菌纲、拟杆菌纲、变形菌纲、Negativicuts纲无显著影响。

饲粮中铜对产蛋期种鹅盲肠的梭菌纲影响显著，在4 mg/kg的铜添加组梭菌纲更低。

在微生物丰度排名前10，丰富比例高于0.1%，且在相似性为97%的纲水平下，所有盲肠样品共检测到21个不同的菌纲，Ⅰ组检测到18菌纲；Ⅱ、Ⅲ组检测到21个菌纲；Ⅳ组检测到19个菌纲；Ⅴ组检测到20个菌纲；Ⅵ组检测到17个菌纲。

其中梭菌纲（Clostridia）、拟杆菌纲（Bacteroidia）变形菌纲（Deltaproteobacteria）、Negativicuts纲、红蝽菌纲（Coriobacteriia）是相对丰度更高的5个优势菌纲。

Ⅰ~Ⅴ组梭菌纲（Clostridia）的相对丰度分别是47.28%、37.86、47.32%、44.55%、39.22%，低于Ⅵ组57.11%的相对丰度；Ⅱ、Ⅴ组的拟杆菌纲（Bacteroidia）相对丰度高于剩余各组，分别为37.83%和38.62%；Ⅵ组变形菌纲（Deltaproteobacteria）的相对丰度更低，为1.32%。

Ⅴ组的变形菌纲（Deltaproteobacteria）相对丰度更高为7.51%，，与Ⅵ组变形菌纲（Deltaproteobacteria）相对丰度相比提高了468.94%；Ⅳ组的Negativicuts纲相对丰度更高为6.72%，剩余各组Negativicuts纲的相对丰度大小依次为Ⅴ组˃Ⅲ组˃Ⅰ组˃Ⅵ组˃Ⅱ组；Ⅵ组红蝽菌纲（Coriobacteriia）的相对丰度为5.13%。

纲水平优势菌群多样性分析 %

产蛋期种鹅盲肠菌群科水平丰度的影响

在相似性97%的科水平下，不同水平的铜与BS协同对种鹅盲肠的瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）无显著影响。

饲粮中铜对种鹅盲肠的脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）影响显著，在4 mg/kg的铜添加组梭菌纲更低。

科水平优势菌群多样性分析 %

在微生物丰度排名前十，丰富比例高于0.1%，且在相似性为97%的科水平下，计算种鹅盲肠样品中检测到的微生物科。

一共检测到56个菌科，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ组检测到50个菌科，Ⅲ组检测到56个菌科，Ⅴ组检测到44个菌科。

其中瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）等为主要的优势菌科。

瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的相对丰度在Ⅵ组中更高，在Ⅰ组中更低，两者的数值分别是36.86%和31.45%，且Ⅱ~Ⅵ组之间瘤胃菌科（Ruminococcaceae）相对丰度有逐渐升高的趋势；Ⅱ组拟杆菌科（Bacteroidaceae）相对风度高于剩余各组，且Ⅱ~Ⅵ组之间的拟杆菌科（Bacteroidaceae）相对丰度呈逐渐降低的取值，数值分别为28.39%、20.98%、20.25%、20.38%、15.39%；Ⅲ组的毛螺菌科（Lachnospiraceae）相对丰度更高为8.97%，显著高于剩余各组，Ⅱ、Ⅴ组的脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）相对丰度显著高于剩余各组，分别为7.30%和7.51%。

消化球菌科（Peptococcaceae）丰度水平在Ⅵ组中更高为6.233%，消化链球（Peptostreptococcaceae）的相对丰度在Ⅳ组中更高为7.68%。

说明添加不同水平的铜和BS使种鹅盲肠微生物科水平丰度发生了变化，对种鹅改变盲肠菌群有明显的影响。

3.1 不同水平铜和BS互作对产蛋期种鹅空肠形态和组织学的影响

肠道是动物对营养物质吸收消化的主要场所，其形态结构的稳定性对于保证动物正常生命活动具有十分重要的作用。

动物机体的肠绒毛及其柱状上皮细胞、肠管上的环形皱襞是动物吸收营养物质的主要部位，肠绒毛高度越高消化吸收能力越好。

BS作为一种绿色安全无毒无残留的微生态制剂在生产中有许多的应用。

周勃[研究表明，在肉鸡饲粮中添加适量的BS能明显提高肉鸡小肠黏膜VH以及V/C。

谢鹏等研究表明，在亲本鸽饲粮中添加400~600 mg/kg的BS能显著提高仔鸽的肠道绒毛发育和肠道有益菌的数量，对维持仔鸽肠道内环境稳态有积极的促进作用。

张明爱等研究发现，在低铜饲粮中添加250 mg/kg的BS能极显著提高5~16周龄五龙鹅空肠的VH和V/C，显著降低CD。

在本试验中，不同水平的铜和BS互作对产蛋期种鹅空肠VH、CD以及V/C都影响显著，BS或铜也都单独对种鹅的VH、CD和V/C影响显著。

本试验与上述报道研究结果一致，BS与铜能够协同促进产蛋期种鹅空肠绒毛生长，保护肠道黏膜生理健康。

然而，关于BS与铜的协同机制还有待进一步的探究。

不同水平铜和BS产蛋期种鹅盲肠优势菌群分析

动物体的肠道微生物菌群是一个非常复杂的微生态系统，对动物机体的营养代谢、免疫调节和肠道保护都具有十分重要的意义。

动物肠道中的微生物菌群在提高其抗病力方面也有一定的帮助。

有研究表明，人体肠道中微生物的主要优势菌群是拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes），两者占据总细菌量的70%以上，且主要是专性厌氧菌。

Hooper研究发现，动物机体的肠道微生物在肠道中的黏附位点上通过定殖抗力与营养物质竞争性结合之后，通过产生乳酸和细菌素来抵抗外源性的病原菌和致病菌在肠道中附着定殖。

在本试验结果中，Ⅲ组的Shannon指数更大，Simpson指数最小，表明其物种多样性最丰富；Ⅱ组Simpson指数更大，Shannon指数最小，表明Ⅱ组的肠道微生物多样性更低，剩余各组的物种多样性也都不同，表明铜和BS显著改善了产蛋期种鹅盲肠的物种多样性；肠道菌群的多样性是保证动物机体肠道微生态稳定的重要因素。

覃初斌研究发现，BS能显著提高肉仔鸡的菌群多样性，显著提高变形菌门（proteobacteria）、疣微菌门（verrucomicrobia）、拟杆菌门（bacteroidetes）的菌群比例。

Sen等研究发现，在肉仔鸡饲粮中添加BS能提高生产性能，减少肠道内大肠杆菌数量，提高双歧杆菌数量，保持肠道微生物区系平衡，维持机体健康。

Turnbaugh等研究指出，动物脂代谢与肠道内的微生物菌群有关，肠道内的厚壁菌门与拟杆菌门的比值越高，其脂肪沉积越高，是因为厚壁菌门通过发酵能产出较多的短链脂肪酸，有利于脂肪沉积。

在禽类肠道优势菌群的研究中，有人认为厚壁菌门是优势菌群[26]，也有人认为是拟杆菌门。

在本试验中，种鹅的优势菌群是厚壁菌门，造成不同结果可能是因为所选试验动物所处的试验日龄、个体差异、生存环境、消化环境不同。

在本研究中，分别从门、纲、科3个层面分析不同水平的铜和BS协同对产蛋期种鹅盲肠菌群结构的影响，结果表明铜和BS协同改变了种鹅盲肠菌群结构，维持了肠道菌群平衡。

综上，产蛋期种鹅饲粮中添加适宜枯草芽孢杆菌促进了肠道发育、优化了肠道菌群结构，进而促进了各种营养吸收；由于益生菌具有将饲粮中无机微量元素转化有机微量元素的功能，大大提高了微量元素吸收率，饲粮中铜添加量4 mg/kg效果还优于6 mg/kg，降低了无机铜添加量33%，从而减少了重金属排泄和对生态环境的污染；此研究结果为家禽养殖饲粮在添加益生菌条件下微量元素如何添加使用提供了明确 *** ，同时也为微量元素减量化使用奠定了理论基础。

本试验结果显示，适量的铜和BS添加量均能够促进产蛋期种鹅肠道绒毛生长，改善肠道结构。

铜和BS协同能够显著改善种鹅肠道微生物菌群丰度，提高益生菌优势菌群比例，维持肠道内环境微生态平衡。

建议产蛋期种鹅饲粮在添加枯草芽孢杆菌250 mg/kg条件下铜添加量为4 mg/kg。