油脂发酵(产油酵母发酵醪液油脂提取及溶剂筛选的 *** 有哪些)

农村养殖畜牧网养殖技术 2023-11-04 14:24:042310

文 | 威猛贝塔

编辑 | 威猛贝塔

●○前言○●

为建立简易高效的微生物油脂提取 *** ，以圆红酵母发酵醪液为原料，直接用溶剂对其进行处理，评估了24种溶剂的提取性能，研究结果表明：弱极性溶剂袁如甲基叔丁基醚、氯仿、二氯乙烷等可直接从圆红酵母细胞中提取油脂，而短链醇类极性溶剂及桂类非极性溶剂均不能提取油脂。

使用尼罗红和碘化丙唳对细胞进行染色后发现，极性和弱极性溶剂破坏了细胞膜和脂滴膜，有利于提取胞内油脂，利用低毒性的甲基叔丁基醯和乙酸乙酯处理发酵醪液，油脂提取率分别达到了85%和59%，且所得脂质的组成与酸热法提取的油脂相似。

●○实验材料与 *** ○●

油脂是人类生活中不可或缺的重要大宗产品，可替代化石资源作为化学工业和可再生能源产业的基本加工原料，据《中华人民共和国2021年国民经济和社会发展统计公报》，我国2021年进口植物油1039万t，进口大豆9652万t，油脂资源进口依存度远高于原油。

近年来，油脂资源进口有遭到封锁的危险，我国亟需建设、补充和完善油脂供给，某些产油微生物可在胞内积累油脂达细胞干重20%以上。

与种植油料作物相比，利用产油微生物将碳水化合物和农林废弃物转化为油脂，具有生产周期短、不受气候和土地限制等优势，是一种有潜力的新型油脂生产方式，微生物油脂的主要成分是甘油三酯，其脂肪酸组成与植物油相似，因而可用于油脂化工和液体生物燃料行业药。

由于产油微生物细胞体积微小、细胞壁坚韧且成分复杂，导致胞内脂质很难像油料植物种子那样直接压榨得到，微生物油脂的提取 *** 一般涉及细胞预处理和溶剂提取过程，细胞预处理 *** 通常有珠磨法、高压均质化等机械 *** ，加热、微波、超声、脉冲电击等物理 *** 以及酸处理、酶解等化学生物 *** 铁不同，细胞预处理 *** 对细胞油脂是人类生活中不可或缺的重要大宗产品。

圆红酵母是综合性状极其优良的产油酵母，可利用复杂原料发酵，胞内油脂含量可达细胞干重的70%以上，已被广泛应用于微生物油脂技术研究中，为建立简易高效的油脂提取 *** ，本文以圆红酵母发酵醪液为原料，直接用溶剂对其进行处理。

并评估了24种溶剂的提取性能，这些溶剂包括醇类、醛类、酯类、烷炷类及氟代烷和氯代烷类，通过对细胞进行染色观察和对所提取的油脂进行组分分析，初步揭示了溶剂性质与提取能力的关系，最终提出了采用甲基叔丁基醛处理发酵醪液的微生物油脂提取新 *** 。

使用24种溶剂直接提取发酵液中的油脂，与水互溶的使用正己烷反萃，水提取组作为空白对照，酸热法提取的脂质为总油脂，取发酵液10mL与等体积溶剂混合，在温度为30℃，转速为200r/min的培养箱中提取60min，然后在常温下离心8000r/min3min，分离萃取相，加入等体积的质量分数为0，1%的氯化钠溶液洗涤，萃取相过无水 *** 钠干燥，旋蒸除去溶剂后，在105℃下烘干油脂至恒重，得到各溶剂直接提取的油脂。

每克干细胞加入6mL4mol/L的HCl溶液，在78℃下水解1h，然后加入等体积的氯仿和甲醇，涡旋振荡5min，随后在常温下离心5min，分离有机相，再加入等体积的氯仿进行二次萃取，分离并合并有机相，加入等体积的质量分数为0，1%的氯化钠溶液洗涤，萃取相过无水 *** 钠干燥，旋蒸除去溶剂后，在105℃下烘干油脂至恒重。

尼罗红染料可将活细胞内的脂质体染成红色，菌液中加入终浓度为1g/mL的尼罗红丙酮溶液，将提油前后的细胞染色，避光染色，在显微镜细胞成像系统RFP荧光通道下放大400倍观察染色情况。

碘化丙啶染料可对失去膜的完整性的细胞染色，也可用于鉴别细胞是否死亡，将提油前后的细胞染色，在显微镜细胞成像系统RFP荧光通道下放大400倍观察染色晴况，另外，挑取24种溶剂提油后的菌泥划线至YEPD固体培养基上，于28℃下培养3d，检查细胞存活情况。

使用高效薄层色谱法分离极性脂和中性脂问，标准品为0.303g/L的磷脂0.806g/L的甘油单酯、1.612g/L的甘油二酯、0.509g/L的游离脂肪酸和5.002g/L的甘油三酯。

将提取的24组油脂样品使用氯仿稀释20倍后，用自动点样器，起始点样位置为20mm，点样长度为3mm，点样间隔为6mm，总上样量为4滋L，硅胶板尺寸为20cmx10cm，点样至硅胶板，然后在装有展开剂的层析缸中展开10~15min。

●○实验结果○●

常见的微生物油脂提取溶剂有甲醇，乙醇，氯仿，正己烷，乙酸乙酯等，以这些常用溶剂为基础，延伸岀性质梯度性变化的溶剂及衍生物，并尝试使用其他可能的溶剂，多来自常用溶剂、绿色或生物基溶剂、还有食品、医用溶剂或工业添加剂。

这些溶剂的蒸气压较高，易于与油脂分离，除几种醇类以外，其他溶剂均可与水相分层，且能大量获取，发酵后期的圆红酵母中存在TAG，DAG，MAG和FFA，它们均属于中性脂，脂类分子以脂肪酸为结构单元，通常占总脂质的80%以上，是微生物油脂的主要组分，还有一类来源于膜结构的PL，属于极性脂，一般占总脂质的10%以下。

基于“相似相溶”原理，非极性溶剂可较好地溶解脂质，且极性溶剂能与极性脂形成氢键从而破坏膜结构，因此使用极性各异的溶剂进行油脂提取叫经不同溶剂提取油脂后，使用薄层色谱法做定性与半定量分析，结果见图，S为脂质标准品的层析条带。

从图1可以看岀：S9，S11，S12，S14，S15，S16，S17和S23提取的细胞内脂质较多、种类齐全，提油能力强，S10，S13和S19提取的脂质较少，但脂质种类较全，提油能力偏弱，S2，S4，S5和S22只能提取极少的部分极性脂，拥有较长碳链的S4，S5和S22还可提取一些游离脂肪酸，S1，S3，S6，S7，S8，S18，S20和S21几乎提不岀脂质。

24种溶剂提油后，细胞的显微观察结果如图2，S24作为空白对照所示，从下图可以看岀，提油后的细胞形态可大致分为3种，之一种，细胞体积较大，胞内脂滴膜融合，但脂质没有透岀细胞，如S1，S2，S3，S4，S5，S6，S10，S13和S22，这些多为醇类溶剂提取后的细胞，醇类溶剂极性较强，易与水互溶，与中性脂相溶性较差，即使破坏了细胞膜，也难以提岀被“细胞壁笼”包裹的油脂。

第二种，细胞体积明显变小，呈空壳状，大脂滴消失，仅残留少许脂质，如S9，S11，S12，S14，S15，S16，S17和S19，这些多为酯类、醸类、氯代烷类等弱极性溶剂提取后的细胞，溶剂可以穿透细胞壁和细胞膜将胞内脂质萃取岀来。

第三种，细胞与脂滴形态均正常，如S7，S8，S18，S20和S21，这些多为烷桂、氟代烷等非极性溶剂提取后的细胞，非极性溶剂无法进入细胞，不会破坏胞内脂滴，也无法直接提取油脂。将提油后的菌泥划线至YEPD平板上，细胞的生长情况如图3所示。从图3可以看岀，使用S7，S8，S18，S19，S20，S21和S24提油后，细胞仍然存活，与图2中的结果可以相互印证。

从图中可以看岀：S10，S13和S19提取的油脂量太少，脂质组成较为片面，与酸热法提岀的脂质组成相比，差异过大，S14的提取效果较好，但TLC板上岀现了拖尾，可能影响数据分析，其余溶剂提岀的油脂中，TAG占总脂质的70%〜80%，DAG占5%〜10%，MAG占1%〜2%，FFA占9%〜12%，PL占4%〜6%，其中FFA的占比较酸热法高。

溶剂的性质会影响脂质提取的偏好性，由于S10和S13提取的油脂太少，难以进行转酯化，因此，对其余样品进行转酯化并做GC-MS分析，由下图可知，除S14提取的油脂中C18：2含量偏低外，其余各溶剂提取的油脂的脂肪酸组成均与酸热法相当。

上述数据表明，在脂质和脂肪酸组成方面，溶剂法提取的油脂与常规提取 *** 提取的油脂差异不大，且溶剂直接提取脂质无需干燥也无需破碎细胞壁，单纯的物理提取过程能较好地保留胞内产物，可以作为快速提取胞内脂质的手段，使检测胞内脂质类等产物更加高效，选择提油溶剂时，首先要考虑溶剂的提油能力及其对环境的友好程度，然后是分离难度和价格。

高效的提油溶剂往往具有相似的性质，可以从溶剂理化性质上判断该溶剂是否适合用来提取油脂，其中，溶剂S1，S2，S3，S4，S6和S22与水互溶，无法直接提取岀脂质，不考虑使用。